ZR-75-30細(xi)胞，傳代細(xi)胞培養(yang)

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ZR-75-30細(xi)胞(bao)，傳(chuan)代細(xi)胞(bao)培養(yang)[實驗步(bu)驟1]

1、準備工作：1）肥皂(zao)洗手，在進(jin)行(xing)無(wu)菌(jun)(jun)操作前，用75% 的(de)(de)酒精(jing)擦拭雙手，注意指間，和(he)指甲周圍。同時，用酒精(jing)棉球(qiu)擦拭超凈(jing)(jing)臺。2）將培(pei)養(yang)液放置(zhi)室(shi)溫，備用。3）打(da)開超凈(jing)(jing)臺內的(de)(de)紫外燈，照射20 min。同時，將實驗(yan)所需材料(liao)也放入超凈(jing)(jing)臺進(jin)行(xing)滅菌(jun)(jun)（血清、培(pei)養(yang)基除(chu)外）4）倒置(zhi)顯微鏡下，觀察細胞的(de)(de)狀態，是否已(yi)經長(chang)滿培(pei)養(yang)瓶，需要進(jin)行(xing)分(fen)瓶。

2、關閉(bi)超凈(jing)臺的紫外燈(deng)，打(da)開風(feng)機。

3、點燃(ran)酒精燈(deng)，取出刻(ke)度吸管，在火(huo)焰(yan)上略燒，然后，安(an)上吸球待(dai)用。

4、在打開(kai)培(pei)養(yang)瓶之前，用酒精(jing)棉球擦拭瓶蓋，打開(kai)后(hou)，瓶口在酒精(jing)燈上過火焰，再用吸管輕輕吸出舊的(de)(de)培(pei)養(yang)液，注意，吸管不要碰到布滿(man)細胞(bao)的(de)(de)培(pei)養(yang)瓶的(de)(de)側(ce)壁(bi)。

5、將胰(yi)酶加入(ru)培(pei)養瓶內,顯(xian)微鏡下隨時觀(guan)察(cha)，見到細(xi)胞(bao)的突起消失，變圓時，立即翻轉培(pei)養瓶，吸出胰(yi)酶。記(ji)住不要消化時間過(guo)長(chang)，否(fou)則(ze)，細(xi)胞(bao)會被胰(yi)酶消化掉。

6、加入適量Hanks液或培養基清洗一遍，立即倒(dao)掉。

7、加入含有10%血(xue)清的培(pei)(pei)養(yang)(yang)基，用(yong)吹(chui)打管吹(chui)打，一定要輕(qing)輕(qing)吹(chui)打，使其從(cong)瓶(ping)(ping)壁上脫落分散到培(pei)(pei)養(yang)(yang)基中，再補加培(pei)(pei)養(yang)(yang)基，按1:3進(jin)行(xing)分瓶(ping)(ping)。然后，用(yong)火焰燒培(pei)(pei)養(yang)(yang)瓶(ping)(ping)的瓶(ping)(ping)口(kou)和蓋，再蓋好(hao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)瓶(ping)(ping)的蓋，放到培(pei)(pei)養(yang)(yang)箱中進(jin)行(xing)培(pei)(pei)養(yang)(yang)。

以(yi)上介(jie)紹的是貼壁細(xi)胞(bao)的傳(chuan)代培(pei)(pei)養(yang)方(fang)法，對于(yu)懸浮(fu)細(xi)胞(bao)的傳(chuan)代培(pei)(pei)養(yang)方(fang)法，只需要將(jiang)細(xi)胞(bao)進行離心，1000 rpm，5 min,然后(hou)，換(huan)入新的培(pei)(pei)養(yang)基(ji)即可(ke)。再分裝到不同的培(pei)(pei)養(yang)瓶中(zhong)進行培(pei)(pei)養(yang)。

不健康的細(xi)胞質中有空(kong)泡(pao)，細(xi)胞內有顆粒樣物質，細(xi)胞間空(kong)隙增大，變形，不規則(ze)，失(shi)去原有的特點。

4. 是否(fou)污染：

傳(chuan)代或換液(ye)24~ 48 h注意觀察細(xi)胞(bao)是(shi)否被污(wu)染，污(wu)染的細(xi)胞(bao)培(pei)養液(ye)變渾(hun)濁(zhuo)(zhuo)，鏡(jing)下可(ke)見有大(da)量菌絲(si)。如(ru)果細(xi)胞(bao)生長緩慢，生長特(te)性(xing)改變，胞(bao)質內顆粒性(xing)物(wu)質增(zeng)多，盡管培(pei)養液(ye)不變渾(hun)濁(zhuo)(zhuo)，考(kao)慮可(ke)能有支(zhi)原體污(wu)染。污(wu)染的細(xi)胞(bao)立即從培(pei)養箱中取(qu)走，以免污(wu)染其它細(xi)胞(bao)。

實驗四(si)、細胞凍存與復蘇

ZR-75-30細胞，傳代細胞培養[實(shi)驗步驟2]

1. 為了保證細(xi)胞(bao)(bao)(bao)良好的(de)狀態，在細(xi)胞(bao)(bao)(bao)凍存的(de)前一天(tian)使(shi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)處于對數增長期(qi)，同時將細(xi)胞(bao)(bao)(bao)換液(ye)，次日，按(an)照細(xi)胞(bao)(bao)(bao)傳代培養(yang)方(fang)法，用胰酶(mei)消化貼壁細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，將細(xi)胞(bao)(bao)(bao)用培養(yang)基(ji)沖下來，然后(hou)，用50 mL尖底離心管(guan)離心，1000 rpm，4min，棄上清，收(shou)集(ji)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)。

2. 加(jia)入適(shi)量的凍(dong)存(cun)液（10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培(pei)養基）

3. 分(fen)裝(zhuang)到凍存管中，做好(hao)標記，標明(ming)細(xi)胞名稱，保存時間，所(suo)用培養(yang)基等(deng)。

4. 4℃放(fang)(fang)置30 min；-20℃放(fang)(fang)置1.5 h； -70℃放(fang)(fang)置12 h；zui后(hou)移到液氮罐中(zhong)。

細胞的(de)復蘇(su)：

細(xi)(xi)胞(bao)的(de)復蘇原則(ze)是快速溶化，因(yin)為如果緩慢(man)的(de)溶化，會使進入細(xi)(xi)胞(bao)的(de)水(shui)分(fen)形成冰晶，對細(xi)(xi)胞(bao)造成傷害，因(yin)此，在復蘇細(xi)(xi)胞(bao)時，將凍(dong)存(cun)細(xi)(xi)胞(bao)直接放到37℃的(de)水(shui)浴中(zhong)，使其迅速溶解。在超凈臺內(nei)(nei)將凍(dong)存(cun)管內(nei)(nei)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)懸浮液(ye)直接倒入小培養(yang)瓶或(huo)培養(yang)皿內(nei)(nei)，然后，加入3 mL的(de)培養(yang)液(ye)。次日，觀察細(xi)(xi)胞(bao)生長情況，并(bing)更換細(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)液(ye)。

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