HCMEC/D3細胞| HCMEC/D3細胞(bao)系 培養(yang)步驟(zou)

產品名稱：HCMEC/D3細胞

中文名稱：永生(sheng)化人腦(nao)微血管內皮細胞；HCMEC/D3

規(gui)格：T25

供應商：上海慧穎(ying)生物科技有限公司

復蘇周期(qi)：10個工作日左(zuo)右

培養步驟：

1）復蘇細(xi)(xi)胞：將含(han)有1mL細(xi)(xi)胞懸液(ye)(ye)的凍(dong)存管在(zai)(zai)37℃水浴中(zhong)迅速搖(yao)晃(huang)解(jie)凍(dong)，加入(ru)5mL培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基混合均勻(yun)。在(zai)(zai)1000RPM條件下離心(xin)5分鐘，棄去上清液(ye)(ye)，補(bu)加4-6mL*培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基后吹勻(yun)。然(ran)后將所(suo)有細(xi)(xi)胞懸液(ye)(ye)加入(ru)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶中(zhong)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)過(guo)夜（或將細(xi)(xi)胞懸液(ye)(ye)加入(ru)6cm皿中(zhong)），培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)過(guo)夜。第二(er)天換液(ye)(ye)并檢查細(xi)(xi)胞密度。

2）細胞傳代：如(ru)果細胞密度達(da)80%-90%，即可進行傳代培養。

1、對于(yu)貼壁細胞，傳代(dai)可參考以(yi)下(xia)方法：

1. 棄去培養上清，用(yong)不含(han)鈣、鎂離子的PBS潤(run)洗細(xi)胞1-2次。

2. 加1-2ml消化(hua)液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中(zhong)，置于37℃培養箱中(zhong)消化(hua)1-2min，然后(hou)在顯微鏡下觀察細(xi)胞(bao)消化(hua)情況，若細(xi)胞(bao)大(da)部(bu)分變圓并脫(tuo)落，迅速拿回操作臺，輕(qing)敲幾下培養瓶后(hou)加5ml以上(shang)含10%血清的*培養基終止消化(hua)。

3.輕(qing)輕(qing)吹打細(xi)胞，*脫(tuo)落后(hou)吸出(chu)，在(zai)1000RPM條件(jian)下(xia)離(li)心8-10分(fen)鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yang)液后(hou)吹勻。

4. 按5-6ml/瓶補加培養液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新(xin)的含5-6 ml培養液的新(xin)皿中或者瓶中。

PS：若(ruo)客(ke)戶收(shou)到(dao)2ml小(xiao)管(guan)(guan)細(xi)胞(bao)，收(shou)到(dao)細(xi)胞(bao)后(hou)，用75%酒(jiu)精(jing)噴灑(sa)整(zheng)個管(guan)(guan)子消毒(du)后(hou)放(fang)到(dao)超(chao)凈臺或(huo)(huo)安全柜內，嚴格無菌操作；將小(xiao)管(guan)(guan)細(xi)胞(bao)轉移至T25培(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶或(huo)(huo)6cm培(pei)養(yang)(yang)(yang)皿，加入5ml左(zuo)右*培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)混勻，放(fang)入培(pei)養(yang)(yang)(yang)箱(xiang)過(guo)夜培(pei)養(yang)(yang)(yang)后(hou)查(cha)看細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)(du)：若(ruo)密(mi)度(du)(du)未超(chao)過(guo)80%，換液繼續培(pei)養(yang)(yang)(yang)，視情況(kuang)傳代(dai)或(huo)(huo)者凍存。若(ruo)密(mi)度(du)(du)超(chao)過(guo)80%，可直(zhi)接進行傳代(dai)（方法同上）。

2、對(dui)于懸浮細胞，傳代可參考(kao)以下方法(fa)：

方法(fa)一：收(shou)集細胞，1000RPM條件下離(li)心8-10分鐘，棄去上清(qing)液，補加1-2mL培(pei)(pei)養液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的(de)(de)比例分到新的(de)(de)含8ml培(pei)(pei)養基的(de)(de)新皿中或(huo)者瓶中。

方(fang)法(fa)二：可選擇半數換液方(fang)式，棄(qi)去半數培(pei)養(yang)基后，將(jiang)剩余(yu)細胞懸起，將(jiang)細胞懸液按1：2到(dao)1：3的(de)(de)比例(li)分到(dao)新的(de)(de)含8ml培(pei)養(yang)基的(de)(de)新皿中或者瓶中。

3）細(xi)胞(bao)(bao)凍存(cun)：待(dai)細(xi)胞(bao)(bao)生長狀態良(liang)好時，可進行細(xi)胞(bao)(bao)凍存(cun)。貼壁細(xi)胞(bao)(bao)凍存(cun)時，棄去培(pei)養基后加入少量胰(yi)酶，細(xi)胞(bao)(bao)變圓脫落后，進行離心(xin)(xin)收(shou)集，1000RPM條件下離心(xin)(xin)8-10分鐘，去除上清，按凍存(cun)數量加入血(xue)清及DMSO，凍存(cun)比(bi)例為90%FBS+10%DMSO。

PS：若客戶(hu)收到(dao)2ml小管細(xi)(xi)胞，收到(dao)細(xi)(xi)胞后(hou)，用75%酒精噴(pen)灑整個管子消(xiao)毒后(hou)放到(dao)超凈(jing)臺或安全柜內，嚴(yan)格無(wu)菌操作；將小管細(xi)(xi)胞轉(zhuan)移至T25培(pei)(pei)養瓶或6cm培(pei)(pei)養皿，加入(ru)5ml左右(you)*培(pei)(pei)養基混勻，放入(ru)培(pei)(pei)養箱過夜培(pei)(pei)養后(hou)查看細(xi)(xi)胞密度(du)：若密度(du)未(wei)超過80%，換液繼續培(pei)(pei)養，視(shi)情況傳代或者凍(dong)存(cun)。若密度(du)超過80%，可(ke)直接進行傳代（方法同上）。

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