原代細胞、傳代細胞絕大多數都呈混合生長，既有上皮樣細胞又有纖維樣細胞，纖維樣細胞又包括成纖維細胞、肌細胞、骨細胞、滑膜細胞等。混雜的細胞會直接影響實驗結果。

在體外培養原代(dai)細(xi)胞(bao)(bao)時，為(wei)(wei)了(le)保(bao)證實驗結(jie)果的(de)可靠性、一(yi)致性、穩定(ding)性、和(he)可重(zhong)復性，要(yao)(yao)(yao)求(qiu)采用單一(yi)種(zhong)類細(xi)胞(bao)(bao)來(lai)進行實驗，這(zhe)樣才(cai)能(neng)對某一(yi)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)功能(neng)、形態等變化進行一(yi)系列(lie)研究，因而培養細(xi)胞(bao)(bao)的(de)純化就成為(wei)(wei)實驗研究的(de)重(zhong)要(yao)(yao)(yao)一(yi)步，甚至需要(yao)(yao)(yao)從混雜(za)的(de)細(xi)胞(bao)(bao)群中分(fen)離(li)出(chu)單個細(xi)胞(bao)(bao)來(lai)進行培養和(he)開展(zhan)實驗研究。

一、原代細胞增殖優勢純化方法：

自然(ran)純化是(shi)利用(yong)某一種(zhong)類細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)增殖優勢(shi)(shi)，在長期(qi)傳(chuan)代過程(cheng)中靠(kao)自然(ran)淘汰法(fa)，不斷(duan)(duan)排(pai)擠其他生長慢的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，靠(kao)自然(ran)增殖的(de)(de)潛力，最后留下(xia)生長優勢(shi)(shi)旺盛的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，達到細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)純化的(de)(de)目(mu)的(de)(de)。但(dan)這(zhe)種(zhong)方法(fa)常無(wu)法(fa)按照需要(yao)和實驗要(yao)求及(ji)研究(jiu)目(mu)的(de)(de)來(lai)(lai)選擇細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。此法(fa)花(hua)費時(shi)間長，留下(xia)的(de)(de)往往是(shi)成纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。僅有那(nei)些惡變(bian)的(de)(de)腫瘤細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)或突(tu)變(bian)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)可以通過此方法(fa)而保留下(xia)來(lai)(lai)的(de)(de)，不斷(duan)(duan)純化而建立(li)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)系。

二、原代細胞常用純化方法：

人工純(chun)化是利(li)用人為手段造成(cheng)對(dui)某一細胞生長有(you)利(li)的(de)(de)環境條(tiao)件(jian)，抑制其他細胞的(de)(de)生長從(cong)而(er)達到純(chun)化細胞的(de)(de)目的(de)(de)。

 1、細胞(bao)時間(jian)差酶消化法：

酶(mei)消化(hua)法是(shi)(shi)比較常用的(de)純(chun)(chun)化(hua)方法，不僅(jin)對貼(tie)(tie)(tie)壁細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)可行，能利用上皮細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和成纖維(wei)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)對胰蛋白酶(mei)的(de)耐受(shou)性不同，是(shi)(shi)兩(liang)者分(fen)開，達(da)到純(chun)(chun)化(hua)的(de)目的(de)；另外對貼(tie)(tie)(tie)壁細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)與半貼(tie)(tie)(tie)壁細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)及黏附細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)間的(de)分(fen)離純(chun)(chun)化(hua)也是(shi)(shi)十分(fen)有效的(de)。

兩者在(zai)胰蛋白(bai)酶(mei)的(de)作(zuo)用下，由于成纖維細胞(bao)(bao)(bao)先脫壁，而上(shang)皮細胞(bao)(bao)(bao)要消化相當長的(de)時間才(cai)脫壁，特別是(shi)在(zai)原代(dai)(dai)細胞(bao)(bao)(bao)初次傳代(dai)(dai)和早期傳代(dai)(dai)中兩種差別尤為明顯(xian)，故可采(cai)用多(duo)次差別消化方法將(jiang)上(shang)皮細胞(bao)(bao)(bao)和成纖維細胞(bao)(bao)(bao)分開(kai)，方法步驟如下：

采(cai)用常(chang)規消化傳代方式(shi)將0.25%胰(yi)蛋白酶注入培養(yang)瓶內兩次，每次加(jia)1ml（25ml培養(yang)瓶），來(lai)回(hui)輕搖1-2次，使胰(yi)蛋白酶流(liu)過所(suo)有細(xi)胞(bao)表面，然(ran)后(hou)倒掉。

蓋好瓶(ping)塞，將培養(yang)(yang)瓶(ping)放在倒置顯微鏡下觀察，發現成纖維細(xi)胞變園，部分脫落，立即加入2ml有血清的培養(yang)(yang)基終止消(xiao)化。

用(yong)彎頭吸管輕輕吹打(da)成纖維細(xi)胞生(sheng)長區域(yu)（可事先在鏡下用(yong)記(ji)號(hao)筆在培養(yang)瓶上劃出記(ji)號(hao)）。吹打(da)時不(bu)要用(yong)力，也不(bu)要吹打(da)上皮細(xi)胞生(sheng)長區域(yu)。吹打(da)結束后(hou)，再用(yong)少量(liang)培養(yang)基漂洗一遍，然(ran)后(hou)加入適量(liang)培養(yang)基于瓶內繼續培養(yang)，也可重復上述操作再進行(xing)一次。

隔幾日(ri)后或(huo)下次傳(chuan)代時，再進行上述(shu)操作，進過幾次處(chu)理，就可將(jiang)成纖維(wei)細胞去除(chu)或(huo)者將(jiang)兩者分開。

2、細胞培養(yang)機(ji)械(xie)刮除法：

原代培養(yang)時，如果(guo)上皮細胞和成纖維細胞分為(wei)區成混(hun)雜生(sheng)長，每種細胞都以小片或(huo)區域(yu)(yu)性分布的方式生(sheng)長在瓶(ping)壁上。可(ke)采(cai)用機(ji)械(xie)的方法去除(chu)不(bu)需要的細胞區域(yu)(yu)而保留需要的細胞區域(yu)(yu)，其方法步(bu)驟如下 ：

將要純化(hua)細胞的培(pei)養瓶，在(zai)凈化(hua)室內放在(zai)倒置顯微鏡監視下(xia)進行(xing)操作。

用硅橡膠刮子在(zai)不(bu)需要生長的細胞(bao)(bao)區域(yu)推劃，使細胞(bao)(bao)懸浮在(zai)培養(yang)基(ji)中，注意不(bu)要傷(shang)及所需細胞(bao)(bao)。

推劃后(hou)用(yong)培養基沖洗振搖(yao)兩(liang)次倒掉(diao)，即可將(jiang)培養基加(jia)入原瓶繼續培養。

數日(ri)后如發現不需要的(de)細胞又(you)長出，可再進行(xing)上述操作，這樣反復多次可以純化細胞。操作過程中(zhong)要嚴格無菌(jun)操作，防止污染。

3、細胞反復貼(tie)壁法(fa)：

成(cheng)纖維細胞(bao)與上(shang)皮細胞(bao)相比(bi)，其(qi)貼壁過(guo)程(cheng)快(kuai)，大部分(fen)細胞(bao)能在(zai)短(duan)時間(jian)內（大約10-30min）完(wan)成(cheng)附著(zhu)過(guo)程(cheng)（但不一定*伸展），而(er)上(shang)皮細胞(bao)（大部分(fen)）在(zai)短(duan)時間(jian)內不能附著(zhu)或附著(zhu)不穩定，稍加振蕩即浮起，利用(yong)此差別可以純化細胞(bao)。

將細(xi)胞懸液接種在一個(ge)培(pei)養內（最好培(pei)養基內不含(han)血清，此時上(shang)皮細(xi)胞貼壁更慢）靜置20min。

在倒置顯微鏡下觀察，見(jian)部分細胞貼壁，稍加搖(yao)動也不(bu)浮(fu)起時(shi)，將(jiang)細胞懸液導入另一培(pei)養瓶中。

繼續靜置培養20min，然(ran)后重(zhong)復(fu)上(shang)述(shu)(shu)操作后，即可將上(shang)皮細胞(bao)和成(cheng)纖維細胞(bao)分隔開(kai)(kai)，在第一瓶(ping)和第二瓶(ping)以(yi)成(cheng)纖維細胞(bao)為主，往后幾瓶(ping)即以(yi)上(shang)皮細胞(bao)為主，下次傳代時再按上(shang)述(shu)(shu)方(fang)法處理，就可使兩者達到(dao)*分開(kai)(kai)的目的。

4、細胞電烙篩選法(fa)：

在貼壁細(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化(hua)時，往(wang)(wang)往(wang)(wang)在培養瓶(ping)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)層中會出(chu)現分散的(de)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化(hua)灶(zao)，轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化(hua)灶(zao)區域細(xi)(xi)胞(bao)(bao)密集(ji)、排列規(gui)則，有(you)明(ming)顯生長趨勢，與周邊未(wei)能轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化(hua)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)有(you)明(ming)顯的(de)區域界限，此時即(ji)可用機械刮除法取(qu)出(chu)未(wei)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化(hua)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，也可用電烙篩選法燙死(si)未(wei)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化(hua)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)而(er)保留轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化(hua)灶(zao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)。

倒去原液，并用記號筆劃(hua)出(chu)轉化灶的(de)區域。

用(yong)加熱(re)的(de)(de)微型電(dian)烙(luo)器(qi)（類似焊(han)接(jie)用(yong)的(de)(de)電(dian)烙(luo)鐵）將(jiang)轉化(hua)灶周(zhou)邊(bian)的(de)(de)細(xi)胞全部燙死，只保留轉化(hua)灶細(xi)胞。在單細(xi)胞克隆篩選時(shi)，也可用(yong)此(ci)法將(jiang)單個細(xi)胞周(zhou)圍的(de)(de)細(xi)胞殺死。

然后在適(shi)應性培養基中（50%是(shi)原液）繼續培養，即(ji)可達到純化的目(mu)的。