細胞(bao)培養技(ji)術(shu)

1. 冷凍管應如何(he)解凍？ 
　　取出冷凍管后， 須立即放入37 ℃水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。 
2. 細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO？
　　除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。 
3. 可否使用與原先培養條件不同之培養基？ 
　　不能。每一(yi)細胞株均有其特定(ding)使用且已適(shi)應之(zhi)細胞培養(yang)(yang)基(ji)， 若(ruo)驟然使用和原先提供之(zhi)培養(yang)(yang)條件不同(tong)之(zhi)培養(yang)(yang)基(ji)， 細胞大(da)都無法立即適(shi)應， 造成(cheng)細胞無法存活。 
4. 可否使用與原先培養條件不同之血清種類？
　　不(bu)能。血清(qing)(qing)是細(xi)胞培(pei)養上(shang)一個極為重(zhong)要的營養來源， 所以血清(qing)(qing)的種類和品質對于細(xi)胞的生長(chang)會(hui)產生極大的影響。來自不(bu)同物種的血清(qing)(qing)， 在一些(xie)物質或(huo)分(fen)子(zi)的量或(huo)內(nei)容物上(shang)都有所不(bu)同，血清(qing)(qing)使用錯誤常會(hui)造成細(xi)胞無法存(cun)活。 
5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ? 
　　FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。 
6. 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？ 
　　一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10 % CO2；當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養細胞。 
7. 何時須更換培養基？ 
　　視(shi)細(xi)胞生長密度而(er)定， 或遵照細(xi)胞株基本數(shu)據上(shang)之(zhi)更換(huan)時間，按(an)時更換(huan)培養(yang)基即(ji)可。 
8. 培養基中是否須添加抗生素？ 
    除于特殊篩選系統中外， 一般正常培養狀態下， 培養基中不應添加任何抗生素。 
9. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？ 
　　一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 ℃，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。 
10. 懸浮性細胞應如何繼代處理？
　　一(yi)般僅需持續加(jia)入新(xin)(xin)鮮(xian)培(pei)養(yang)(yang)基于原培(pei)養(yang)(yang)角(jiao)瓶中， 稀(xi)釋(shi)細胞(bao)濃度(du)(du)即(ji)可， 若(ruo)培(pei)養(yang)(yang)液(ye)太多時， 可將培(pei)養(yang)(yang)角(jiao)瓶口(kou)端稍微抬高， 直到(dao)無法容納為止。分瓶時取出一(yi)部份含細胞(bao)之培(pei)養(yang)(yang)液(ye)至(zhi)另一(yi)新(xin)(xin)的培(pei)養(yang)(yang)角(jiao)瓶， 加(jia)入新(xin)(xin)鮮(xian)培(pei)養(yang)(yang)基稀(xi)釋(shi)至(zhi)適(shi)當濃度(du)(du)， 重(zhong)復(fu)前(qian)述步驟即(ji)可。 
11. 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
　　欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg （約1,000rpm），5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。 
12. 細胞之接種密度為何？ 
　　依照細(xi)胞株(zhu)基本數(shu)據(ju)上之(zhi)接種密度(du)或(huo)稀(xi)釋(shi)分(fen)盤之(zhi)比例接種即(ji)可。細(xi)胞數(shu)太少或(huo)稀(xi)釋(shi)的太多(duo)亦是(shi)造(zao)成細(xi)胞無法生(sheng)長之(zhi)一(yi)重要原(yuan)因。 
13. 細胞冷凍培養基之成份為何？
　　動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。 
14. DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 
　　冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即為無菌狀況， *次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。
15. 冷凍保存細胞之方法？ 
　　冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 
　　冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中(zhong)，惟存活(huo)率稍微(wei)降(jiang)低(di)一些。 
16. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
　　冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 
17. 應如何避免細胞污染？ 
　　細(xi)(xi)胞污染(ran)的(de)種類可分成細(xi)(xi)菌(jun)、酵母菌(jun)、霉(mei)菌(jun)、病毒(du)和(he)霉(mei)漿(jiang)菌(jun)。主要(yao)的(de)污染(ran)原因為無菌(jun)操(cao)(cao)作技術不(bu)當、操(cao)(cao)作室環境(jing)不(bu)佳(jia)、污染(ran)之(zhi)血清和(he)污染(ran)之(zhi)細(xi)(xi)胞等。嚴格之(zhi)無菌(jun)操(cao)(cao)作技術、清潔的(de)環境(jing)、與品質(zhi)良好之(zhi)細(xi)(xi)胞來源和(he)培養基(ji)配制是(shi)減低污染(ran)之(zhi)方法。 
18. 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？ 
　　加(jia)入(ru)相應(ying)抗生素。直接(jie)滅菌(jun)后丟棄之。 
19. 支原體（mycoplasma） 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 
　　不能。除極(ji)有(you)經驗之專家(jia)外(wai)，大多數遭受(shou)支(zhi)原體污染的細(xi)胞株，無法(fa)以其(qi)外(wai)觀(guan)分辨(bian)之。 
20. 支原體污染會對細胞培養有何影響？ 
　　支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數， 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。 
21. CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？
　　定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

來源：慧穎生物實驗(yan)室

技術咨(zi)詢： 

訂購： 

：王