人硫化氫（H2S）酶聯免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書

本(ben)試劑(ji)僅供研(yan)究使用       目的：本(ben)試劑盒用于測定人血(xue)清，血(xue)漿及(ji)相關(guan)液體樣本(ben)中硫化氫（H2S ）的含量。

實驗原(yuan)理：

  本試劑盒應(ying)用雙抗體夾心法測定標本中人硫化氫（H2S ）水平。用純化的(de)人硫化氫（H2S ）抗(kang)體包被微(wei)孔板，制成固(gu)相抗(kang)體，往(wang)包被單抗(kang)的微(wei)孔中依次加入硫化氫（H2S ），再(zai)與HRP標記(ji)的(de)硫化氫（H2S ）抗體結合(he)，形成抗體-抗原-酶標抗體(ti)(ti)復合物，經(jing)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在(zai)HRP酶的催(cui)化(hua)(hua)下(xia)(xia)轉化(hua)(hua)成(cheng)藍色，并在酸的作(zuo)用下(xia)(xia)轉化(hua)(hua)成(cheng)zui終的黃色。顏(yan)色的深淺(qian)和樣(yang)品中的硫化氫（H2S ）呈正相(xiang)關。用酶標(biao)儀在450nm波長下測定吸(xi)光度(du)（OD值(zhi)），通過標準曲線計算樣品中人(ren)硫化氫（H2S ）濃度。

試劑盒組成：

樣本處理及要求(qiu)：

1. 血(xue)(xue)清：室溫血(xue)(xue)液自(zi)然凝固10-20分鐘，離心(xin)20分(fen)鐘左右（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細收集上清(qing)，保存過程(cheng)中如(ru)出現沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬(meng)酸鈉作(zuo)為抗(kang)凝劑，混合10-20分鐘后，離(li)心20分鐘左右(you)（2000-3000轉/分）。仔細收集上(shang)清，保存過程中(zhong)如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液(ye)：用無菌管(guan)收集，離心20分鐘左右(you)（2000-3000轉/分）。仔細(xi)收(shou)集上清(qing)，保存過程中如有(you)沉淀形(xing)成，應(ying)再次離心(xin)。胸腹水、腦脊液參照(zhao)實(shi)行。

4. 細胞培養上(shang)清：檢測(ce)分泌(mi)性的成份時，用無菌(jun)管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細(xi)收(shou)集上清。檢測(ce)細(xi)胞內(nei)的成份(fen)時，用(yong)PBS（PH7.2-7.4）稀釋(shi)細胞懸液，細胞濃度達到(dao)100萬/ml左(zuo)右。通過(guo)反復(fu)凍融，以使細胞(bao)(bao)破壞(huai)并(bing)放出細胞(bao)(bao)內成份(fen)。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集(ji)上清。保(bao)存過(guo)程中如有沉淀形成(cheng)，應(ying)再次(ci)離心。

5. 組(zu)織標本：切(qie)割標本后，稱取重(zhong)量。加(jia)入(ru)一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅(xun)速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的(de)(de)溫度(du)。加(jia)入一定量的(de)(de)PBS（PH7.4），用手(shou)工或勻漿器將標(biao)本(ben)勻漿充分。離(li)心20分(fen)鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收集(ji)上清。分(fen)裝(zhuang)后(hou)一份(fen)待檢(jian)測，其余冷凍備(bei)用。

6. 標本采集(ji)后(hou)盡早(zao)進(jin)行(xing)(xing)提取，提取按相(xiang)關(guan)文獻進(jin)行(xing)(xing)，提取后(hou)應盡快(kuai)進(jin)行(xing)(xing)實驗。若不能(neng)馬上進(jin)行(xing)(xing)試驗，可(ke)將(jiang)標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融(rong).

7. 不能檢測含NaN3的樣品(pin)，因NaN3抑制辣根過氧化(hua)物酶的（HRP）活性。

操作步驟：

1．   標準品的(de)稀釋與加樣(yang)：在酶(mei)標包被板上設(she)標準品孔10孔(kong)，在*、第二(er)孔(kong)中分(fen)別加標準(zhun)品100μl，然后在*、第二孔中(zhong)加標(biao)準(zhun)品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔(kong)、第二孔(kong)中各取100μl分別(bie)加到第三(san)孔(kong)和第四(si)孔(kong)，再在第三(san)、第四(si)孔(kong)分別(bie)加標準(zhun)品(pin)稀釋液50μl，混勻；然后在第(di)三孔(kong)和(he)第(di)四孔(kong)中先各取50μl棄掉(diao)，再(zai)各取(qu)50μl分別加到第五、第六(liu)孔中(zhong)，再在(zai)第五、第六(liu)孔中(zhong)分別加標準品稀釋(shi)液(ye)50ul，混勻；混勻后從(cong)第(di)五、第(di)六孔中各取50μl分別加到(dao)第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混(hun)勻(yun)后從第(di)七、第(di)八孔中分別(bie)取50μl加(jia)(jia)到第(di)(di)九、第(di)(di)十孔中，再在第(di)(di)九第(di)(di)十孔分(fen)別加(jia)(jia)標(biao)準品(pin)稀(xi)釋液(ye)50μl，混勻后從第九第十(shi)孔(kong)中各取50μl棄掉。（稀釋(shi)后各(ge)孔加樣量都為50μl，濃度分別為(wei)0.48 pg/ml，0.32 pg/ml，0.16 pg/ml，0.08 pg/ml， 0.04 pg/ml）。

2．   加樣：分別設(she)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各(ge)步操(cao)作相(xiang)同(tong)）、待測樣品(pin)孔。在酶標包(bao)被板上待測樣品(pin)孔中先加樣品(pin)稀釋(shi)液(ye)40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋(shi)度為(wei)5倍）。加(jia)樣(yang)將樣(yang)品(pin)加(jia)于酶標板孔(kong)底(di)部(bu)，盡量不觸及孔(kong)壁，輕輕晃動(dong)混(hun)勻。

3．   溫(wen)育：用封(feng)板膜封(feng)板后(hou)置37℃溫育30分鐘。

4．   配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀(xi)釋后(hou)備用。

5．   洗(xi)滌：小心揭(jie)掉(diao)封板膜，棄去液(ye)體，甩干，每孔加滿洗(xi)滌液(ye)，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干(gan)。

6．   加酶：每孔加入酶標試(shi)劑50μl，空白孔除外(wai)。

7．   溫育：操作(zuo)同3。

8．   洗滌(di)：操(cao)作(zuo)同5。

9．   顯(xian)色(se)：每孔先加入顯(xian)色(se)劑A50μl，再(zai)加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10．             終止(zhi)：每孔加終止(zhi)液50μl，終止(zhi)反應（此(ci)時藍色(se)立(li)轉黃色(se)）。

11．          ;   測(ce)定：以空(kong)白空(kong)調(diao)零，450nm波長(chang)依(yi)序測量各孔的(de)吸光度(du)（OD值）。 測定應在(zai)加終止(zhi)液后(hou)15分(fen)鐘以內進行。

注意(yi)事項：

1.      試(shi)劑盒從冷藏(zang)環境中取出(chu)應(ying)在(zai)室溫平衡15-30分鐘后(hou)方可(ke)使用，酶標包被板開封后(hou)如未(wei)用完，板條應裝入密封袋中保存。

2.      濃洗滌液(ye)可能(neng)會有結(jie)(jie)晶析出，稀(xi)釋時(shi)可在水浴中加溫助溶(rong)，洗滌時(shi)不影(ying)響結(jie)(jie)果。

3.      各(ge)步加(jia)樣(yang)均應使用加(jia)樣(yang)器，并(bing)經常(chang)校對其(qi)準確性，以避免試驗誤差。一次加(jia)樣(yang)時(shi)間控制在5分(fen)鐘內，如標本數(shu)量(liang)多，推薦使(shi)用排槍加樣。

4.      請每次(ci)測(ce)定的同時(shi)做標(biao)準曲線，做復(fu)孔。如(ru)標(biao)本中待測(ce)物質含量過(guo)高（樣本OD值大于標(biao)準品孔(kong)(kong)*孔(kong)(kong)的OD值），請先(xian)用樣品稀(xi)釋液稀(xi)釋一定(ding)倍數（n倍）后(hou)再測(ce)定(ding)，計算時(shi)請zui后(hou)乘(cheng)以(yi)總稀釋倍數(shu)（×n×5）。

5.      封(feng)板膜只限一次性使用，以避免(mian)交叉污染。

6.      底(di)物請避光(guang)保存。

7.      嚴格按照說明書的操(cao)作進行，試驗結(jie)果判(pan)定必須以(yi)酶標儀讀數(shu)為準.

8.      所有(you)樣品(pin)，洗滌液和各(ge)種廢棄物都應(ying)按傳染物處理(li)。

9.      本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如(ru)與英(ying)文(wen)說明(ming)書有異，以英(ying)文(wen)說明(ming)書為準(zhun)。

計算：

以(yi)標(biao)準物的濃度(du)為(wei)橫坐標(biao)，OD值為縱坐(zuo)標，坐(zuo)標紙(zhi)上繪出標準曲線(xian)，根據樣品的(de)OD      值由標準曲線(xian)查出相應的(de)濃(nong)度；再乘以稀釋(shi)倍(bei)數；或用標準物(wu)的(de)濃(nong)度與(yu)OD值(zhi)計算出標      準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出(chu)樣品濃(nong)度，再乘以稀釋     

倍數，即為(wei)樣品的實際濃度。                 

試(shi)劑(ji)盒性能(neng)：

1.樣品線性回(hui)歸與預期濃度相關系數R值為(wei)0.92以上。

2.批(pi)內(nei)與批(pi)間應分別小于9%和15%

檢測范圍(wei)：                                             

0 pg/ml -0.5pg/ml                                   

保存條(tiao)件及有效(xiao)期：

1.試劑(ji)盒(he)保存：；2-8℃。

2．有效(xiao)期：6個月(yue)