本公司承(cheng)諾，凡購(gou)買我(wo)(wo)公司魚(yu)卵黃蛋白原（VTG）Elisa試劑盒，我(wo)(wo)們提(ti)供免費代測服務，自收到(dao)樣(yang)本三個工作日(ri)內完成(cheng)實驗和數據處理。

產品(pin)名稱：魚卵(luan)黃蛋白原（VTG）Elisa試劑盒(he)，Fish vilogenin （VTG） ELISA Kit

實(shi)驗模型設計：本(ben)試劑盒(he)用于(yu)測定(ding)魚血清，血漿(jiang)，及相關液體樣本(ben)中卵黃蛋白原（VTG）的含量(liang)。

方法：酶(mei)免、elisa

樣品(pin)對應編號：

試(shi)劑盒(he)性能：

1.樣品(pin)線性(xing)回(hui)歸(gui)與預(yu)期濃(nong)度(du)相關系數R值為(wei)0.92以上。

2.批內與批見應分別小于9%和15%

檢測范圍：3ng/ml -150ng/ml

保存溫度(du)：2-8°C

有效期：6個月

實驗原理：

本(ben)試劑盒(he)應(ying)用(yong)雙抗(kang)(kang)體(ti)(ti)夾(jia)心法測(ce)定標本(ben)中魚(yu)(yu)卵(luan)黃(huang)(huang)(huang)蛋(dan)白(bai)(bai)原(yuan)（VTG）水平(ping)。用(yong)純化的(de)魚(yu)(yu)卵(luan)黃(huang)(huang)(huang)蛋(dan)白(bai)(bai)原(yuan)（VTG）抗(kang)(kang)體(ti)(ti)包被(bei)微孔板，制成(cheng)固(gu)相(xiang)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)，往包被(bei)單抗(kang)(kang)的(de)微孔中依次(ci)加入卵(luan)黃(huang)(huang)(huang)蛋(dan)白(bai)(bai)原(yuan)（VTG）再與HRP標記的(de)VTG抗(kang)(kang)體(ti)(ti)結(jie)合(he)，形成(cheng)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)-抗(kang)(kang)原(yuan)-酶標抗(kang)(kang)體(ti)(ti)復合(he)物，經過*洗(xi)滌后加底物TMB顯色(se)(se)。TMB在(zai)HRP酶的(de)催化下轉化成(cheng)藍色(se)(se)，并(bing)在(zai)酸的(de)作用(yong)下轉化成(cheng)zui終的(de)黃(huang)(huang)(huang)色(se)(se)。顏色(se)(se)的(de)深淺和樣品中的(de)卵(luan)黃(huang)(huang)(huang)蛋(dan)白(bai)(bai)原(yuan)（VTG）呈正(zheng)相(xiang)關。用(yong)酶標儀(yi)在(zai)450nm波(bo)長下測(ce)定吸光度(du)（OD值(zhi)），通過標準曲線計算樣品中魚(yu)(yu)卵(luan)黃(huang)(huang)(huang)蛋(dan)白(bai)(bai)原(yuan)（VTG）濃度(du)。

試劑盒組(zu)成：

操作步驟：

1．  標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)(pin)的稀(xi)釋(shi)與加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)樣：在(zai)(zai)酶(mei)標(biao)(biao)(biao)包被板上設標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)(pin)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)10孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)，在(zai)(zai)*、第(di)(di)(di)(di)(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)(pin)100μl，然(ran)后(hou)在(zai)(zai)*、第(di)(di)(di)(di)(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻(yun)(yun)；然(ran)后(hou)從(cong)*孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)、第(di)(di)(di)(di)(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)各取100μl分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)三(san)(san)(san)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)和第(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)，再(zai)(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)三(san)(san)(san)、第(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻(yun)(yun)；然(ran)后(hou)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)三(san)(san)(san)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)和第(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)先各取50μl棄掉(diao)，再(zai)(zai)各取50μl分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六(liu)(liu)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，再(zai)(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六(liu)(liu)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)50ul，混(hun)勻(yun)(yun)；混(hun)勻(yun)(yun)后(hou)從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六(liu)(liu)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)各取50μl分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，再(zai)(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻(yun)(yun)后(hou)從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)取50μl加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)、第(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，再(zai)(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)第(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)標(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻(yun)(yun)后(hou)從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)第(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)各取50μl棄掉(diao)。（稀(xi)釋(shi)后(hou)各孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)加(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)樣量都為50μl，濃度分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)為120ng/ml，80ng/ml ，40ng/ml，20ng/ml， 10ng/ml）。

2．    加(jia)(jia)樣(yang)：分別(bie)設空白(bai)孔(kong)（空白(bai)對照孔(kong)不(bu)加(jia)(jia)樣(yang)品(pin)(pin)及(ji)酶(mei)(mei)標(biao)(biao)試劑，其(qi)余各(ge)步操(cao)作相同）、待測(ce)(ce)(ce)樣(yang)品(pin)(pin)孔(kong)。在酶(mei)(mei)標(biao)(biao)包被板上待測(ce)(ce)(ce)樣(yang)品(pin)(pin)孔(kong)中先(xian)加(jia)(jia)樣(yang)品(pin)(pin)稀釋液(ye)40μl，然后再(zai)加(jia)(jia)待測(ce)(ce)(ce)樣(yang)品(pin)(pin)10μl（樣(yang)品(pin)(pin)zui終稀釋度為5倍）。加(jia)(jia)樣(yang)將(jiang)樣(yang)品(pin)(pin)加(jia)(jia)于(yu)酶(mei)(mei)標(biao)(biao)板孔(kong)底部，盡量不(bu)觸及(ji)孔(kong)壁，輕輕晃動混(hun)勻。

3．    溫育：用封板膜封板后置37℃溫(wen)育30分鐘。

4．    配(pei)液：將30（48T的20倍(bei)(bei)(bei)）倍(bei)(bei)(bei)濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍(bei)(bei)(bei)）倍(bei)(bei)(bei)稀釋(shi)后備用。

5．    洗(xi)滌(di)：小心揭掉封(feng)板膜，棄(qi)去液體，甩(shuai)干，每孔(kong)加(jia)滿洗(xi)滌(di)液，靜(jing)置30秒后棄(qi)去，如此重復5次，拍干。

6．    加酶：每孔加入酶標(biao)試劑(ji)50μl，空(kong)白孔除外。

7．    溫育：操作(zuo)同(tong)3。

8．    洗滌：操(cao)作同5。

9．    顯色(se)：每孔先加(jia)入顯色(se)劑A50μl，再加(jia)入顯色(se)劑B50μl，輕輕震(zhen)蕩(dang)混勻，37℃避光顯色(se)15分鐘.

10．終(zhong)止：每(mei)孔加終(zhong)止液50μl，終(zhong)止反應（此時藍(lan)色立轉黃色）。

測定：以空(kong)白空(kong)調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

計(ji)算(suan)：

以標(biao)準物(wu)的(de)(de)濃(nong)度為橫坐(zuo)(zuo)標(biao)，OD值為縱坐(zuo)(zuo)標(biao)，在坐(zuo)(zuo)標(biao)紙(zhi)上繪出標(biao)準曲線，根據樣品的(de)(de)OD值由(you)標(biao)準曲線查出相應的(de)(de)濃(nong)度；再(zai)乘以稀釋倍數(shu)；或用標(biao)準物(wu)的(de)(de)濃(nong)度與OD值計算出標(biao)     

準曲線(xian)的直(zhi)線(xian)回歸方程式(shi)，將樣(yang)品(pin)的OD值(zhi)代入方程式(shi)，計(ji)算出樣(yang)品(pin)濃度，再(zai)乘以稀釋(shi)     

倍數，即為(wei)樣品的實際濃度(du)。

注(zhu)意事項：

1.       試劑盒從冷藏環境中取出應(ying)在室溫(wen)平衡(heng)15-30分鐘(zhong)后(hou)方可使用，酶(mei)標(biao)包被(bei)板(ban)開封后(hou)如(ru)未用完(wan)，板(ban)條(tiao)應(ying)裝(zhuang)入(ru)密封袋中保(bao)存。

2.     濃洗(xi)滌(di)液可能會有結晶析出，稀釋(shi)時(shi)可在水(shui)浴中加溫助(zhu)溶，洗(xi)滌(di)時(shi)不影響結果。

3.     各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準(zhun)確(que)性，以避免試驗誤(wu)差。一次加樣時(shi)間控(kong)制在5分(fen)鐘內，如標本(ben)數量多(duo)，推薦使用排槍加樣。

4.     請(qing)每次(ci)測定的同時做(zuo)標(biao)準(zhun)曲線，做(zuo)復孔。如標(biao)本(ben)中(zhong)待測物(wu)質含量過高（樣本(ben)OD值(zhi)大于標(biao)準(zhun)品孔*孔的OD值(zhi)），請(qing)先用樣品稀釋液(ye)稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請(qing)zui后乘以總(zong)稀釋倍數（×n×5）。

5.     封板(ban)膜只限一次性使用，以避免交叉污(wu)染。

6.     底(di)物(wu)請避光保存。

7.     嚴格按(an)照(zhao)說明書(shu)的操(cao)作進(jin)行，試驗(yan)結(jie)果判定必須(xu)以酶(mei)標(biao)儀讀數為準.

8.     所有樣品，洗滌(di)液和各種廢棄(qi)物(wu)都應按(an)傳染(ran)物(wu)處理。

9.     本(ben)試劑不同批號組(zu)分不得(de)混用。

樣本處理及要求：

1. 血清(qing)：室溫血液自然凝固10-20分(fen)鐘，離心20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集上(shang)清(qing)，保存(cun)過程(cheng)中如出(chu)現(xian)沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應(ying)根據標本的要(yao)求(qiu)選擇EDTA或檸(ning)檬酸鈉作(zuo)為抗凝(ning)劑，混(hun)合10-20分鐘(zhong)后(hou)，離(li)心20分鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保(bao)存(cun)過(guo)程中如有沉淀(dian)形成，應(ying)該再次離(li)心。

3. 尿液：用無菌管收集(ji)，離(li)心(xin)(xin)20分(fen)鐘左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收集(ji)上清(qing)，保存過(guo)程中如有沉淀形成，應再次離(li)心(xin)(xin)。胸腹水(shui)、腦脊液參照實行。

4. 細(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)上(shang)(shang)清：檢測分(fen)泌性(xing)的成份時，用無菌管收集(ji)(ji)(ji)。離心20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zi)細(xi)(xi)收集(ji)(ji)(ji)上(shang)(shang)清。檢測細(xi)(xi)胞(bao)內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xi)(xi)胞(bao)懸液，細(xi)(xi)胞(bao)濃度達到(dao)100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細(xi)(xi)胞(bao)破壞并放(fang)出細(xi)(xi)胞(bao)內成份。離心20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zi)細(xi)(xi)收集(ji)(ji)(ji)上(shang)(shang)清。保存(cun)過程中(zhong)如有沉淀形成，應(ying)再次離心。

5. 組織標(biao)本：切(qie)割標(biao)本后(hou)，稱取重量(liang)(liang)。加入一定(ding)(ding)量(liang)(liang)的(de)PBS，PH7.4。用(yong)(yong)液(ye)氮迅速冷凍保存備用(yong)(yong)。標(biao)本融化后(hou)仍然保持2-8℃的(de)溫(wen)度。加入一定(ding)(ding)量(liang)(liang)的(de)PBS（PH7.4），用(yong)(yong)手工或(huo)勻(yun)漿器將標(biao)本勻(yun)漿充(chong)分(fen)。離心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收(shou)集上(shang)清。分(fen)裝后(hou)一份待檢測(ce)，其余冷凍備用(yong)(yong)。

6. 標(biao)本(ben)采集后盡早(zao)進(jin)行提(ti)取，提(ti)取按相關(guan)文獻進(jin)行，提(ti)取后應(ying)盡快進(jin)行實驗(yan)。若不能馬上進(jin)行試驗(yan)，可將標(biao)本(ben)放于-20℃保存，但應(ying)避免(mian)反(fan)復凍融.

7. 不(bu)能檢測含NaN3的(de)樣品，因NaN3抑制辣根過氧(yang)化物酶的(de)（HRP）活性。