PIINP大鼠Ⅱ型前膠(jiao)原(yuan)氨基端原(yuan)肽Elisa試劑盒(he)說明書

產品名稱：大鼠Ⅱ型前膠原氨基端原肽（PIINP）Elisa試劑盒

英(ying)文名稱：Rat N-terminal procollagen II propeptide（PIINP）ELISA Kit

規(gui)格：96T

檢測范圍：100ng/L -3000ng/L

適合樣本(ben)：大鼠血清(qing)、血漿(jiang)、組(zu)織液、尿液、腦脊液等

靈(ling)敏(min)度：95%

特異性98%

運輸方式：2-8°C

有(you)效(xiao)期(qi)：6個(ge)月

PIINP大鼠Ⅱ型前膠原氨(an)基(ji)端原肽Elisa試劑(ji)盒 實驗(yan)目的(de)：本(ben)試劑盒用于定量測定大鼠血(xue)清，血(xue)漿及(ji)相關液體樣本(ben)中Ⅱ型(xing)前(qian)膠原氨基端原肽（PIINP）的(de)含(han)量。

本試劑(ji)僅(jin)供研(yan)究使(shi)用  不得用于體內(nei)診斷(duan)

樣本(ben)處理及(ji)要(yao)求：

1. 血清：室(shi)溫血液自然凝固10-20分(fen)鐘，離心20分(fen)鐘左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集上清，保(bao)存過程中如出現沉淀(dian)，應再次(ci)離心。

2. 血漿：應(ying)根據標(biao)本的要(yao)求選(xuan)擇(ze)EDTA或檸檬酸鈉作(zuo)為(wei)抗凝劑，混合10-20分(fen)鐘后，離(li)心20分(fen)鐘左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收集(ji)上清，保存(cun)過程中如(ru)有沉淀形成，應(ying)該再(zai)次離(li)心。

3. 尿液(ye)：用無菌(jun)管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuan)/分）。仔細收集上清，保存過(guo)程中如有(you)沉淀形成，應再次離心。胸腹水(shui)、腦(nao)脊液(ye)參照實行(xing)。

4. 細(xi)胞(bao)培養上清：檢(jian)測(ce)分(fen)泌性的成份時，用無菌(jun)管(guan)收集。離心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集上清。檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xi)胞(bao)懸液，細(xi)胞(bao)濃度達到(dao)100萬/ml左右(you)。通過(guo)反復凍融，以使細(xi)胞(bao)破(po)壞并放出細(xi)胞(bao)內成份。離心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集上清。保存過(guo)程中(zhong)如有沉淀形成，應再次離心(xin)。

5. 組織(zhi)標(biao)本：切割標(biao)本后，稱取重量。加入(ru)一(yi)(yi)定量的PBS，PH7.4。用(yong)液(ye)氮迅速冷凍保(bao)存備(bei)用(yong)。標(biao)本融化后仍然(ran)保(bao)持2-8℃的溫度。加入(ru)一(yi)(yi)定量的PBS（PH7.4），用(yong)手工(gong)或勻(yun)漿器將標(biao)本勻(yun)漿充(chong)分(fen)。離心20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zi)細收集上清(qing)。分(fen)裝后一(yi)(yi)份待檢測，其余(yu)冷凍備(bei)用(yong)。

6. 標本(ben)采集后盡早(zao)進(jin)行提取，提取按(an)相關文(wen)獻(xian)進(jin)行，提取后應(ying)盡快進(jin)行實驗(yan)。若不能馬(ma)上進(jin)行試驗(yan)，可將標(biao)本放于-20℃保存，但應(ying)避免反復凍(dong)融.

7. 不能檢(jian)測(ce)含(han)NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根(gen)過氧化物酶的（HRP）活性。

實驗原理(li)：

    本(ben)試劑盒應用(yong)雙抗(kang)(kang)體夾(jia)心(xin)法測(ce)定標本(ben)中大(da)鼠Ⅱ型前膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)氨(an)基端原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)肽(tai)（PIINP）的(de)(de)(de)(de)水平。用(yong)純化的(de)(de)(de)(de)大(da)鼠Ⅱ型前膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)氨(an)基端原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)肽(tai)（PIINP）抗(kang)(kang)體包(bao)被微孔板，制成(cheng)固相抗(kang)(kang)體，往包(bao)被單抗(kang)(kang)的(de)(de)(de)(de)微孔中依(yi)次加入大(da)鼠Ⅱ型前膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)氨(an)基端原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)肽(tai)（PIINP）再與HRP標記的(de)(de)(de)(de)Ⅱ型前膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)氨(an)基端原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)肽(tai)（PIINP）抗(kang)(kang)體結合(he)，形成(cheng)抗(kang)(kang)體-抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)-酶標抗(kang)(kang)體復合(he)物(wu)，經過(guo)*洗滌后加底(di)物(wu)TMB顯色(se)(se)。TMB在HRP酶的(de)(de)(de)(de)催化下轉化成(cheng)藍色(se)(se)，并(bing)在酸的(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)下轉化成(cheng)zui終的(de)(de)(de)(de)黃色(se)(se)。顏色(se)(se)的(de)(de)(de)(de)深淺和(he)樣(yang)品中的(de)(de)(de)(de)Ⅱ型前膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)氨(an)基端原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)肽(tai)（PIINP）呈正相關。用(yong)酶標儀在450nm波長下測(ce)定吸光度(du)（OD值），通過(guo)標準曲線(xian)計算樣(yang)品中大(da)鼠Ⅱ型前膠(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)氨(an)基端原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)肽(tai)（PIINP）濃度(du)。

試劑盒(he)組成：

操作步驟：

1.標準(zhun)(zhun)品的稀釋與(yu)加(jia)(jia)(jia)樣：在(zai)(zai)酶標包被(bei)板(ban)上設標準(zhun)(zhun)品孔(kong)(kong)(kong)(kong)10孔(kong)(kong)(kong)(kong)，在(zai)(zai)*、第(di)(di)(di)(di)(di)二孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)品100μl，然(ran)(ran)后在(zai)(zai)*、第(di)(di)(di)(di)(di)二孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)品稀釋液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻(yun)；然(ran)(ran)后從(cong)*孔(kong)(kong)(kong)(kong)、第(di)(di)(di)(di)(di)二孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)(ge)(ge)取(qu)100μl分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)三孔(kong)(kong)(kong)(kong)和(he)第(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)(kong)，再(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)三、第(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)品稀釋液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻(yun)；然(ran)(ran)后在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)三孔(kong)(kong)(kong)(kong)和(he)第(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)先(xian)各(ge)(ge)(ge)(ge)取(qu)50μl棄(qi)掉(diao)，再(zai)各(ge)(ge)(ge)(ge)取(qu)50μl分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)，再(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)品稀釋液(ye)50ul，混(hun)(hun)勻(yun)；混(hun)(hun)勻(yun)后從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)(ge)(ge)取(qu)50μl分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)，再(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)品稀釋液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻(yun)后從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)取(qu)50μl加(jia)(jia)(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)九、第(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)，再(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)九第(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)品稀釋液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻(yun)后從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)九第(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)(ge)(ge)取(qu)50μl棄(qi)掉(diao)。（稀釋后各(ge)(ge)(ge)(ge)孔(kong)(kong)(kong)(kong)加(jia)(jia)(jia)樣量都為(wei)50μl，濃度分(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)為(wei)2400ng/L，1600ng/L ，800ng/L，400ng/L， 200ng/L。

2.加樣(yang)：分別(bie)設空白孔(kong)（空白對(dui)照孔(kong)不加樣(yang)品及酶(mei)(mei)標試劑，其(qi)余(yu)各步操(cao)作(zuo)相同）、待(dai)測(ce)(ce)(ce)樣(yang)品孔(kong)。在酶(mei)(mei)標包被(bei)板上待(dai)測(ce)(ce)(ce)樣(yang)品孔(kong)中先加樣(yang)品稀(xi)釋(shi)液40μl，然后再加待(dai)測(ce)(ce)(ce)樣(yang)品10μl（樣(yang)品zui終稀(xi)釋(shi)度為5倍）。加樣(yang)將樣(yang)品加于(yu)酶(mei)(mei)標板孔(kong)底部，盡量不觸及孔(kong)壁，輕輕晃(huang)動混勻。

3.溫育：用封板膜(mo)封板后置(zhi)37℃溫育(yu)30分鐘。

4.配液：將(jiang)30（48T的20倍(bei)）倍(bei)濃縮洗滌(di)液用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水30（48T的20倍(bei)）倍(bei)稀釋后備用(yong)。

5.洗滌：小(xiao)心(xin)揭掉(diao)封板膜，棄(qi)去液體，甩干(gan)，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后(hou)棄(qi)去，如此重復5次，拍干(gan)。

6.加酶：每孔加入(ru)酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.溫(wen)育：操作同3。

8.洗滌(di)：操作同(tong)5。

9.顯(xian)色：每孔先加入顯(xian)色劑(ji)A50μl，再加入顯(xian)色劑(ji)B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色(se)15分鐘.

10.終(zhong)止：每(mei)孔加終(zhong)止液50μl，終(zhong)止反應（此時藍(lan)色(se)立轉黃色(se)）。

11.測(ce)定：以(yi)空(kong)白空(kong)調零，450nm波長依序測(ce)量各孔的吸光度（OD值）。 測(ce)定應在加(jia)終止液后15分鐘以(yi)內進行。

計算：

以(yi)標(biao)準物的(de)濃度為橫坐(zuo)標(biao)，OD值為縱坐(zuo)標(biao)，在坐(zuo)標(biao)紙上繪出標(biao)準曲線，根據(ju)樣品的(de)OD值(zhi)由(you)標(biao)準曲線查出相(xiang)應的(de)濃度；再乘以稀釋(shi)倍數；或用標(biao)準物(wu)的(de)濃度與OD值(zhi)計算(suan)出標(biao)準曲(qu)線的直線回歸方(fang)程(cheng)式，將樣(yang)品的OD值代(dai)入(ru)方(fang)程(cheng)式，計算出樣(yang)品濃度，再(zai)乘以(yi)稀釋倍數(shu)，即為樣品的實際濃(nong)度。

注意事項：

1. 試劑(ji)盒從冷藏(zang)環境中(zhong)取出(chu)應在室溫平衡15-30分鐘后(hou)方可使用(yong)，酶(mei)標包被板開封(feng)后(hou)如未用(yong)完，板條(tiao)應裝入(ru)密(mi)封(feng)袋中(zhong)保存。
2. 濃洗滌(di)液可(ke)能會(hui)有結(jie)晶析出(chu)，稀釋時可(ke)在水浴中(zhong)加溫助(zhu)溶，洗滌(di)時不影響結(jie)果。
3. 各步加(jia)樣均應(ying)使(shi)用加(jia)樣器，并經常校對其準確(que)性，以(yi)避免試驗誤差。一次加(jia)樣時間控制在5分鐘內，如標(biao)本數量多，推薦使(shi)用排槍加(jia)樣。
4. 請(qing)每次測(ce)(ce)定的同時(shi)做標(biao)(biao)準曲線，做復孔。如標(biao)(biao)本中待測(ce)(ce)物質(zhi)含量(liang)過高（樣本OD值大于(yu)標(biao)(biao)準品孔*孔的OD值），請(qing)先用樣品稀(xi)釋液稀(xi)釋一(yi)定倍(bei)(bei)數(shu)（n倍(bei)(bei)）后(hou)再測(ce)(ce)定，計算時(shi)請(qing)zui后(hou)乘以總稀(xi)釋倍(bei)(bei)數(shu)（×n×5）。
5. 封板膜只限(xian)一次性使用，以避免交(jiao)叉污染。
6. 底物請避(bi)光保(bao)存。
7. 嚴(yan)格按(an)照說明書的(de)操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準(zhun).
8. 所(suo)有樣(yang)品(pin)，洗(xi)滌液和各種廢棄(qi)物都(dou)應按(an)傳染物處理。
9. 本試(shi)劑(ji)不同批(pi)號(hao)組(zu)分(fen)不得混用。
10. 如與英文(wen)說明(ming)書有異，以英文(wen)說明(ming)書為(wei)準。