小鼠Ⅲ型前膠原肽(tai) (PⅢNP)酶(mei)聯免疫吸(xi)附測定試劑盒

使用說明書(shu) 

（本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨(lin)床診斷!）

聲明：尊敬的(de)客(ke)戶，感謝(xie)您選(xuan)用本公司(si)的(de)產(chan)品(pin)。本產(chan)品(pin)選(xuan)用世界生產(chan)廠家的(de)原料，采用專業ELISA kit生產技術制造。適用于(yu)體(ti)外(wai)定量(liang)檢測小鼠血清(qing)、血漿、組織(zhi)勻漿或細胞培養上清(qing)液中天然和重組PⅢNP濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分！如有疑問，請及時慧穎生物科技有限公司。

試(shi)劑盒組成：

*: [96T/48T]（打開包裝后請及(ji)時檢查所有物(wu)品(pin)是否齊全完整）

檢測原(yuan)理:

本試劑盒采用雙(shuang)抗(kang)體夾心ELISA法。用抗小(xiao)鼠(shu)PⅢNP抗體包(bao)被于(yu)酶標板上(shang)，實驗時標本或標準品中的PⅢNP會與包被抗(kang)體(ti)結合，游離(li)的成分(fen)被洗去。依次加入生物素化的抗(kang)小鼠(shu)PⅢNP抗體和辣根過氧化物酶標記的親(qin)和素(su)。抗小鼠PⅢNP抗(kang)體(ti)與結(jie)合在(zai)包被(bei)抗(kang)體(ti)上的小鼠PⅢNP結合(he)、生物(wu)素(su)與親和素(su)特異(yi)性結合(he)而形成免疫復合(he)物(wu)，游離的成分被洗去。加入顯色底物(wu)(TMB)，TMB在辣根過氧(yang)化物酶(mei)的(de)催化下(xia)現(xian)藍(lan)色，加終(zhong)止(zhi)液(ye)后變黃。用酶(mei)標儀在450nm波(bo)長處(chu)測OD值，PⅢNP濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過繪制標(biao)準曲線求出標(biao)本中(zhong)PⅢNP的濃度。

標本收集:

1.     血清：全血標本于室溫放置2小時或4℃一(yi)夜后于(yu)1000×g離(li)心20分鐘，取上清即可檢(jian)測，收集血液(ye)的試(shi)管(guan)(guan)應(ying)為(wei)一(yi)次(ci)性的無熱原，無內毒素試(shi)管(guan)(guan)。

2.     血漿：抗凝劑推薦(jian)使用EDTA.Na2，標本(ben)采集(ji)后(hou)30分鐘(zhong)內于1000×g離心15分鐘，取(qu)上清即可(ke)檢測(ce)。避免(mian)使用溶(rong)血(xue)，高(gao)血(xue)脂(zhi)標本(ben)。

3.     組織勻漿(jiang)：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗(xi)組織，以去除殘(can)留血液（勻(yun)漿中裂解的紅細(xi)胞會(hui)影響測量結果(guo)），稱重后將(jiang)組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如(ru)1g的組織樣本(ben)對應(ying)9mL的PBS，具(ju)體體積可根據實(shi)驗需要適(shi)當調整，并做好記(ji)錄。推薦在(zai)PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上(shang)充(chong)分(fen)研(yan)磨。為了進一步裂解(jie)組織(zhi)細胞，可(ke)以對勻漿液(ye)進行超聲破碎，或反復凍融。zui后將勻漿液(ye)于5000×g 離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.     細胞(bao)培養(yang)上清：取細胞培養上清于1000×g離心20分鐘(zhong)，除去(qu)雜(za)質及細胞碎(sui)片。取(qu)上清檢測。

5.     其它生物標本：1000×g離心(xin)20分鐘，取上(shang)清即可(ke)檢(jian)測

（具體(ti)處理方法(fa)可參考：//www.elabscience.cn/news2.asp?tid=477 ）

6.     標(biao)本應(ying)清澈透明，懸浮物應(ying)離心去除。

7.     標本收集(ji)后(hou)若不及時(shi)檢測，請(qing)按一次使(shi)用(yong)量分(fen)裝，凍存(cun)于-20℃/-80℃冰箱(xiang)內，避免反復凍(dong)融，1-6月(yue)內檢測(ce),4℃保存的(de)應在(zai)1周內進行(xing)檢測。

8.     如果您的樣本中檢測(ce)物濃度高于(yu)標準品zui高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋(建(jian)議先做(zuo)預實驗，以(yi)確定稀釋倍數)。

試驗所需自備物品:

1. 酶標儀(450nm波(bo)長濾光片(pian))
2. 高精度移(yi)液器，EP管及一次性(xing)吸(xi)頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水
4. 吸(xi)水(shui)紙

檢測前準(zhun)備工作(zuo):

1. 請提(ti)前(qian)20分鐘從(cong)冰箱中(zhong)取出試(shi)劑(ji)盒，平(ping)衡至室溫(wen)。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水(shui)稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃(nong)縮洗(xi)滌液可能有結(jie)晶(jing)，屬(shu)于正常現象，可用40℃水浴(yu)微加(jia)熱使(shi)結晶(jing)*溶(rong)解后再配制洗滌液（加(jia)熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應為室(shi)溫）。
3. 標準品: 加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至(zhi)凍干標(biao)準品中，靜置10分鐘，待(dai)其充分溶解后，輕輕混勻(濃(nong)度為20ng/ml)。然(ran)后根據(ju)需要進行倍比稀(xi)釋(shi)（注：不(bu)要直接在反應孔中進(jin)行倍比(bi)稀釋）。建議(yi)配制(zhi)成以下濃度： 20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0 ng/ml ，樣品稀釋液直(zhi)接作為空(kong)白(bai)孔0ng/ml。如配制10ng/ml標準(zhun)品：取0.5mL 20ng/ml的(de)上述(shu)標準品(pin)加(jia)入含(han)有0.5mL樣品稀(xi)釋液的EP管(guan)中，混勻即(ji)可，其余(yu)濃度依此類推。
4. 生物素化(hua)抗體工作液(ye)：實驗前計算(suan)當次(ci)實驗所需用量（以(yi)100μL/孔計），實際配制(zhi)時(shi)應多(duo)配制(zhi)100-200μL。使(shi)用前(qian)15分鐘，以生物(wu)素化抗(kang)體稀釋液稀釋濃縮(suo)生物(wu)素化抗(kang)體(1:100)成工(gong)作濃度。當(dang)日使(shi)用。
   1. 酶(mei)結合物工作液：實(shi)驗前計(ji)算當次實(shi)驗所(suo)需用量（以100μL/孔計），實際配制(zhi)時應(ying)多配制(zhi)  100-200μL。使用前15分(fen)鐘，以(yi)酶結合物稀釋(shi)液(ye)稀釋(shi)濃縮HRP酶(mei)結合物(1:100)成(cheng)工作(zuo)濃度。當日使用。

洗滌方法:

1. 自(zi)動洗板機(ji)：每孔(kong)加入洗滌液(ye)350μL，注入與吸(xi)出間(jian)隔60秒。
2. 手工洗(xi)板：甩盡孔內液體，在(zai)潔凈(jing)的吸水(shui)紙上(shang)拍干(gan)，每孔加洗(xi)滌液350μL，浸泡(pao)1-2分鐘，吸去（不可(ke)觸及板(ban)壁）或甩掉(diao)酶標板(ban)內(nei)的液體，在厚的吸(xi)水紙上(shang)拍干。

操(cao)作(zuo)步驟:

實驗開始前(qian)，各試劑(ji)(ji)均應平(ping)衡至室溫；試劑(ji)(ji)或(huo)樣品配制時，均需充分混勻，并盡量(liang)避免起泡。

1. 加樣：分別設(she)空(kong)白孔(kong)(kong)(kong)、標準(zhun)孔(kong)(kong)(kong)、待測(ce)樣品(pin)孔(kong)(kong)(kong)。空(kong)白孔(kong)(kong)(kong)加樣品(pin)稀釋液100μL，余(yu)孔分別加標準品(pin)或待測樣品(pin)100μL，注意不(bu)要(yao)有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底(di)部，盡量不(bu)觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給(gei)酶標板覆膜，37℃孵(fu)育(yu)90分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每(mei)個孔(kong)中(zhong)加入(ru)生物素化抗體工作(zuo)液100μL（在使(shi)用前15分鐘內配制），酶標板加(jia)上覆膜(mo)，37℃溫育(yu)1小(xiao)時。
3. 棄(qi)去孔內液體(ti)，甩干，洗板 3次，每次浸(jin)泡(pao)1-2分鐘，大約350μL/每孔(kong)，甩干并在吸水紙上輕拍將孔(kong)內液體拍干。
4. 每孔(kong)加酶結(jie)合物工作液（臨用前15分鐘內配制）100μL，加(jia)上覆膜(mo)，37℃溫育(yu)30分(fen)鐘。
5. 棄去(qu)孔內液(ye)體，甩干(gan)，洗(xi)板5次，方法同步驟3。
6. 每孔加底物溶液(TMB)100μL，酶標板加上覆膜(mo)37℃避光孵育15分鐘左右（根據實(shi)際顯(xian)色情(qing)況酌情(qing)縮短或延長，但不可超過30分(fen)鐘。當(dang)標準孔出(chu)現明(ming)顯(xian)梯度時，即可終止(zhi)）。
7. 每孔加終止液50μL，終(zhong)止反應，此(ci)時藍色(se)立轉黃色(se)。終(zhong)止液的加入順序(xu)(xu)應盡量與底物溶液的加入順序(xu)(xu)相同。
8. 立即用酶標儀(yi)在450nm波長(chang)測量(liang)各孔的光密度(du)（OD值(zhi)）。應提(ti)前打開酶標儀電源，預熱(re)儀器，設置好檢測程序。
9. 實驗(yan)完(wan)畢后將未(wei)用(yong)完(wan)的試劑按(an)規定的保(bao)(bao)存溫(wen)度放回冰箱保(bao)(bao)存。

注(zhu)意事項：

1. 保(bao)存：試劑(ji)(ji)盒中(zhong)各試劑(ji)(ji)請按說(shuo)明(ming)書提示合(he)理(li)存放(fang)。在儲存及溫育過程(cheng)中(zhong)避免將試劑(ji)(ji)暴露在強(qiang)光中(zhong)。所有(you)試劑(ji)(ji)瓶蓋須旋緊以防(fang)止蒸發(fa)和(he)微(wei)生物的污染(ran)，否則可能會(hui)出現錯(cuo)誤的結果。

1. 酶(mei)標板：剛開(kai)啟(qi)的酶標板(ban)孔(kong)中可能會有少許(xu)水樣物(wu)質(zhi)，此為正常現(xian)象，不會對實驗結果造成任何影響。
2. 加(jia)樣：加樣或加試劑時(shi)，*個孔與(yu)zui后(hou)一個孔的加樣時(shi)間間隔如果太大，將會導致不同的 “預溫育”時(shi)間，從(cong)而明顯地影(ying)響到(dao)測量值的(de)準確(que)性(xing)及重(zhong)復性(xing)。每次的(de)加(jia)樣時(shi)間控制在10分鐘內。推(tui)薦設置復孔(kong)。
3. 溫(wen)育(yu)：為防止(zhi)樣品蒸發(fa)，實驗時(shi)(shi)必(bi)須給酶標板覆膜；洗板后(hou)應盡(jin)快進行下步(bu)操作，避免酶標板處于干(gan)燥(zao)狀態；嚴格遵(zun)守給定的溫(wen)育時(shi)(shi)間和(he)溫(wen)度(du)。
4. 洗(xi)滌(di)：洗滌(di)(di)過程(cheng)中(zhong)反(fan)應(ying)孔中(zhong)殘留(liu)的洗滌(di)(di)液應(ying)在吸水(shui)紙(zhi)上拍干，勿(wu)將濾(lv)紙(zhi)直接放入反(fan)應(ying)孔中(zhong)吸水(shui)。在讀數前要(yao)注意(yi)清除底部殘留(liu)的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數。
5. 試劑配制(zhi)：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積(ji)較小，運(yun)輸過程(cheng)會(hui)使(shi)液體沾到管壁或瓶蓋，因此使(shi)用前1000轉/分離心1min，以使附著管(guan)壁或(huo)瓶蓋的液(ye)體沉(chen)積到管(guan)底。取用前(qian)，請用移液(ye)器小心(xin)吹打(da)4-5次使溶液混勻。標準品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液請根據所需用量配制，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時，一(yi)次不(bu)要小于10μL），以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液。若需要分次使用標準品應按照每一次用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存(cun)。避免反(fan)復凍融。
6. 顯色時(shi)間的控制(zhi)：加入底物后請定時觀察(cha)反應(ying)孔的顏色變化(hua)（比如每隔(ge)5分鐘），如梯度(du)已很明顯，請提(ti)前加(jia)入終(zhong)止(zhi)液終(zhong)止(zhi)反應，避免顏色過深影響酶標(biao)儀(yi)讀數。
7. 底物(wu)：底物請(qing)避(bi)(bi)光保存，在儲存和溫育(yu)時避(bi)(bi)免強光直接照射。
8. 混勻：充分輕(qing)微混勻對反應(ying)結果尤為重要，使用微量振蕩器(使(shi)用zui低頻率)，如無(wu)微(wei)量振蕩器，可在反應(ying)前手工輕(qing)輕(qing)敲(qiao)擊酶標板框混勻。
9. 安全：試驗(yan)(yan)中請穿著實驗(yan)(yan)服并帶乳(ru)膠手套做好防護工(gong)作。特別是檢測血(xue)液(ye)或者其他體液(ye)標(biao)本時，請按(an)國家生物試驗(yan)(yan)室安(an)全防護條例執行(xing)。
10. 不同批(pi)號(hao)的(de)試劑盒(he)組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）
11. 試驗(yan)中所用(yong)的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結果！

結果(guo)判斷(duan):

1. 每個標(biao)準(zhun)品(pin)的(de)OD值減去空白孔的OD值(zhi)后作圖，如(ru)設置復孔，則應取其平均值(zhi)計算。以標(biao)準品的濃度(du)為橫坐標(biao)，OD值為縱坐標(biao)，繪(hui)出(chu)標(biao)準(zhun)曲線。亦(yi)可(ke)以OD值為(wei)橫坐標(biao)，標(biao)準品的濃(nong)度為(wei)縱(zong)坐標(biao)，繪出(chu)標(biao)準曲線。
2. 推薦使用專(zhuan)業的曲線制(zhi)作軟(ruan)件，如curve expert 1.3，在軟件界面既可根據樣品OD值，由標準曲線(xian)查出相應的濃度，乘(cheng)以稀釋(shi)倍數；亦可將樣(yang)品(pin)的OD值代入(ru)標準曲線的(de)擬合(he)方(fang)程式(shi)，計算(suan)出樣(yang)品濃(nong)度(du)，再乘以稀釋倍數，即為樣(yang)品的(de)實際濃(nong)度(du)。
3. 若標本OD值高于標(biao)準曲線上限(xian)，應(ying)適(shi)當(dang)稀釋后重(zhong)測，計算濃度時應(ying)乘以稀釋倍數。

靈敏度、檢測(ce)范圍、特異性和重復性:

● 靈敏度：zui小可測0.19ng/ml。

● 檢(jian)測范(fan)圍(wei)：0.31 – 20ng/ml。

● 特異性：可檢測重組(zu)或天然的小鼠PⅢNP，且與(yu)其(qi)它相關蛋白(bai)無交叉(cha)反(fan)應。

● 重復性：板內，板間變異系數(shu)均<10%。

問(wen)題分析(xi)

說明

1. 限于現(xian)有條件及科學技術水平，尚不(bu)能對所有原料進(jin)行全面的鑒定(ding)分析，本產(chan)品(pin)可(ke)能存(cun)在一定(ding)的質量技術風險。
2. zui終(zhong)的實(shi)驗結果與試(shi)劑的有效性、實(shi)驗者的相關操(cao)作以(yi)及當時的實(shi)驗環(huan)境密(mi)切相關，請(qing)務必準(zhun)備(bei)充足的待(dai)測樣(yang)品。
3. 只有全部使用Elab^TM試劑(ji)才能(neng)保證(zheng)檢測效(xiao)果，不(bu)能(neng)混用其他制造(zao)商的產(chan)品。只有嚴格遵守Elab^TM試(shi)劑的實驗說明才會得到*的檢測(ce)結果。
4. 有(you)效期：6個月。
5. 本操作說明同樣適用(yong)于(yu)48T試(shi)劑(ji)盒。