小鼠_TNF-α_elisa試劑盒說明書

本試劑(ji)盒(he)僅供研究使用

檢測范圍：31.2 pg/ml - 2000 pg/ml

zui低檢測限：7.8 pg/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的小鼠TNF-α，且與其他相關蛋(dan)白無交叉(cha)反應。

有效期：6 個月

預期應用：ELISA 法定(ding)量測(ce)定(ding)小(xiao)鼠血(xue)清、血(xue)漿(jiang)、細胞培(pei)養上清或其它相關生物液體中TNF-α

含量。

說明

1．試(shi)劑盒保存：-20℃(較長時間不用時)；2-8℃(頻繁使用時)。

2．濃洗滌(di)液低溫保存會有鹽(yan)析出，稀釋(shi)時可(ke)在水浴中加溫助(zhu)溶。

3．中、英文(wen)說(shuo)明(ming)書可能會有不一致之處，請以英文(wen)說(shuo)明(ming)書為(wei)準。

4．剛開(kai)啟的(de)酶聯板孔(kong)中(zhong)可(ke)能(neng)會(hui)含(han)有少許水樣物質，此(ci)為正常現象，不會(hui)對實驗(yan)結(jie)果(guo)造(zao)成(cheng)任(ren)

何(he)影響。

概述(shu)

腫瘤壞死(si)因子(tumor necrosis factor，TNF)是一種具有多種生物活性的細胞(bao)因子。兔子TNF-α

基因編碼前(qian)(qian)體(ti)蛋白(bai)(bai)，其信(xin)號肽將(jiang)前(qian)(qian)體(ti)蛋白(bai)(bai)固(gu)定在細胞膜上，成(cheng)為具(ju)有活性的跨膜干擾素

(TNF)，分子質量為26×103，經酶切去除信號肽生成分(fen)泌型TNF-α，分子質量為17×103。

TNF-α細(xi)胞(bao)來源廣泛，包括(kuo)各(ge)種(zhong)免疫細(xi)胞(bao)、內皮(pi)細(xi)胞(bao)、成纖維細(xi)胞(bao)、表皮(pi)細(xi)胞(bao)、角(jiao)質細(xi)胞(bao)、

平滑肌細(xi)胞、星形細(xi)胞、成骨細(xi)胞等。

TNF-α具有廣泛的生(sheng)物學活性(xing)，如：參(can)與炎性(xing)反(fan)應(ying)和免疫應(ying)答，抗腫瘤，參(can)與內毒素性(xing)休

克等(deng)病理過程，引起惡病質等(deng)。其(qi)具有(you)雙重作用，,一方(fang)面在機體免疫調(diao)節，機體生理功能(neng)

和抗感染等(deng)方面發(fa)揮(hui)重要作用，另一方面若持(chi)續(xu)釋放或(huo)產生(sheng)過(guo)多則會引起(qi)發(fa)熱(re)!、休(xiu)克、惡

病(bing)質等(deng)，同時TNF-α可(ke)進一步誘導IL-6、IL-8、IL-10 等細(xi)胞因子(zi)的產(chan)生(sheng)，這些促炎性細(xi)胞

北京方程(cheng)生物(wu)

因(yin)子參與體內急性反(fan)應、發(fa)熱(re)反(fan)應、引起趨化肽釋放等，還可使內皮細(xi)胞(bao)活化而(er)導致(zhi)血管通

透性(xing)增加。

實驗原理(li)

用純化的抗(kang)體包(bao)(bao)被(bei)微孔板，制成固相載體，往包(bao)(bao)被(bei)抗(kang)TNF-α抗體的微孔中依次加(jia)入標本或標

準品、生物素化的(de)抗TNF-α抗體、HRP 標記的(de)親(qin)和素，經過*洗滌(di)后用(yong)底物TMB 顯(xian)色。

TMB 在過氧(yang)化(hua)物酶的催化(hua)下(xia)轉化(hua)成藍色，并在酸的作用下(xia)轉化(hua)成zui終的黃(huang)色。顏(yan)色的深淺

和樣品中的TNF-α呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下(xia)測(ce)定吸光(guang)度(OD 值)，計算(suan)樣品(pin)濃

度。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶(mei)聯板(Assay plate )：一塊(96 孔)。

2. 標準品(Standard)：2 瓶(凍(dong)干(gan)品)。

3. 樣品稀(xi)釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。

4. 生物(wu)素標記抗體稀釋液(ye)(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶。

5. 辣(la)根過氧化物酶標記親和素稀(xi)釋液(HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶。

6. 生物素標記抗體(Biotin-antibody)：1×120ul/瓶(1：100)

7. 辣根過氧化物酶(mei)標記親和素(HRP-avidin)：1×120ul/瓶(1：100)

8. 底(di)物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶(ping)。

9. 濃洗滌液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋(shi)25 倍。

10. 終止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

需要而未提供的試(shi)劑和器材

1. 標(biao)準規格酶標(biao)儀(yi)

2. 高速離(li)心(xin)機

3. 電熱恒(heng)溫培養箱

4. 干凈的試管(guan)和Eppendof 管

北(bei)京方程生物

5. 系列可調節移(yi)(yi)液器(qi)及吸頭，一次(ci)檢測樣品較(jiao)多時，用多通道移(yi)(yi)液器(qi)

6. 蒸餾水(shui)，容量(liang)瓶等(deng)

標(biao)本的采集及保存

1. 血(xue)清：全(quan)血(xue)標本請于室溫放(fang)置2 小(xiao)時或4℃一夜后于(yu)1000 x g 離心20 分鐘，取上(shang)清即可

檢測(ce)，或(huo)將標本放(fang)于-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免反復凍融。

2. 血漿：可用EDTA 或肝素作(zuo)為(wei)抗凝劑，標本采集后30 分鐘內(nei)于2 - 8° C 1000 x g 離心15

分鐘，或將標本放于-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但應避免反復(fu)凍融。

3. 細胞培養物(wu)(wu)上(shang)清或其它生物(wu)(wu)標本(ben)：請1000 x g 離心20 分鐘，取上(shang)清即可檢(jian)測，或(huo)將標本

放于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但(dan)應避免反(fan)復凍(dong)融。

注：標本(ben)(ben)溶血會影響zui后檢(jian)測結果，因此溶血標本(ben)(ben)不宜進(jin)行此項(xiang)檢(jian)測。

標本的(de)稀釋原則(ze)：

首先通過文(wen)獻檢索的(de)方(fang)式了解待測樣本(ben)的(de)大致含量，確定適當的(de)稀(xi)釋(shi)倍數。只有稀(xi)釋(shi)至標準(zhun)

曲線的(de)(de)范圍內(nei)，檢測的(de)(de)結果才(cai)是(shi)準確的(de)(de)。稀(xi)釋(shi)的(de)(de)過程中，應做好(hao)詳細的(de)(de)記錄。zui后計算濃度

時，稀釋了“N”倍，標本的(de)濃度應(ying)再(zai)乘以“N”。

標準(zhun)品的稀釋(shi)原(yuan)則：2 瓶，每瓶臨用前以(yi)樣品稀釋(shi)液稀釋(shi)至(zhi)1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，

然(ran)后反復顛倒/搓動以助溶(rong)解，其濃度(du)為2000 pg/ml，做系(xi)列倍比稀釋(shi)后，分別(bie)稀釋(shi)2000

pg/ml，1000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，樣品稀釋液(ye)

直接(jie)作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15 分鐘內配(pei)制。

如配制1000 pg/ml 標準(zhun)品(pin)：取0.5ml(不要少(shao)于0.5ml)2000 pg/ml 的(de)上述標準品(pin)加入含0.5ml

樣品稀釋液(ye)的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度(du)以此類推。

生物素標記(ji)抗體的稀(xi)釋原(yuan)則：

臨用前以(yi)生物素標記抗體稀釋(shi)(shi)液稀釋(shi)(shi)，稀釋(shi)(shi)前根據(ju)預先(xian)計算(suan)好的每次(ci)實驗所需(xu)的總量配制(zhi)

(每(mei)孔100ul)，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul 生物素標記(ji)抗體加990ul 生物素標

記抗體(ti)稀釋液的比例配(pei)制(zhi)，輕輕混勻，在使用前一(yi)小時內(nei)配(pei)制(zhi)。

辣根過(guo)氧(yang)化物酶標記親和素(su)的稀釋(shi)原則：

北京方程生(sheng)物

臨用前以辣根過(guo)氧化物酶(mei)標記親和(he)素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的

總量配制(每孔100ul)，實際配制(zhi)時應多配制(zhi)0.1-0.2ml。如10ul 辣根過(guo)氧化物酶標(biao)記(ji)親和

素加990ul 辣根過氧(yang)化(hua)物酶標記親和(he)素(su)稀(xi)釋液的(de)比例配制，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)混勻，在使用前一小時(shi)內

配制。

操作步驟

實驗開始前(qian)，請(qing)提(ti)前(qian)配置好所(suo)有試劑，試劑或樣(yang)品稀釋時(shi)，均需混勻，混勻時(shi)盡量避(bi)免起泡。

每次檢測都(dou)應該做(zuo)標準曲線。如樣(yang)品濃度過高(gao)時，用(yong)樣(yang)品稀(xi)(xi)釋(shi)液(ye)進(jin)行稀(xi)(xi)釋(shi)，以使樣(yang)品符合試

劑盒的檢測范圍(wei)。

1. 加樣(yang)(yang)：分別(bie)設(she)空白孔、標準孔、待測樣(yang)(yang)品(pin)孔。空白孔加樣(yang)(yang)品(pin)稀釋液100ul，余孔分(fen)別(bie)加標

準品或待測樣品100ul，注意(yi)不(bu)要有氣泡(pao)，加樣將樣品加于酶標板孔(kong)底部，盡量不(bu)觸及孔(kong)壁，

輕(qing)輕(qing)晃動混(hun)勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120 分鐘。

為保證實驗(yan)結果有(you)效性，每次(ci)實驗(yan)請使用新(xin)的標(biao)準(zhun)品溶液。

2. 棄去液(ye)體，甩(shuai)干，不用洗滌。每孔(kong)加生物(wu)素標記抗體工作液(ye)100ul(取1ul 生物素標記抗

體加99ul 生物素標(biao)記抗(kang)體(ti)稀釋液(ye)的(de)比例配(pei)制，輕(qing)輕(qing)混勻，在使用前一小時內配(pei)制)，37℃,60

分鐘(zhong)。

3. 溫育(yu)60 分鐘后(hou)，棄去孔內液體(ti)，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘(zhong)，350ul/每孔，甩干(gan)。

4. 每孔加辣根過氧化物酶(mei)標記親和素工作液(同生(sheng)物素(su)標記抗體(ti)工作(zuo)液) 100ul，37℃，60

分鐘(zhong)。

5. 溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5 次(ci)，每次(ci)浸泡1-2 分(fen)鐘，350ul/每孔，甩干(gan)。

6. 依序每(mei)孔加底物(wu)溶液90ul，37℃避光顯(xian)色(30 分鐘內，此時肉眼可(ke)見(jian)標(biao)準品的前(qian)3-4 孔

有明顯的梯度藍(lan)色(se)，后(hou)3-4 孔梯(ti)度不明顯，即可(ke)終止)。

7. 依序每孔加(jia)終止溶液50ul，終止反(fan)應(此時藍色(se)立轉黃色(se))。終(zhong)止液的加(jia)入順序應盡量與

底物(wu)液的加(jia)入順序相同。為了保(bao)證實驗結果(guo)的準確性，底物(wu)反應時間到后應盡快加(jia)入終止液。

8. 用酶聯儀在450nm 波長依序(xu)測量各孔的光密度(du)(OD 值)。在加終止液后15 分鐘以內進

行檢測(ce)。

北京方程生(sheng)物(wu)

注：

1. 用(yong)戶在初次使用(yong)試劑盒時，應(ying)將各種試劑管(guan)離心數分鐘，以便試劑集中(zhong)到管(guan)底(di)。

2. 每(mei)次實驗(yan)留(liu)一孔(kong)作為空(kong)白調零(ling)孔(kong)，該孔(kong)不(bu)加任何(he)試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。

測量時先用此孔調(diao)OD 值至零。

3. 為防(fang)止樣品(pin)蒸發(fa)，試驗時(shi)將反應(ying)板(ban)放于鋪有濕(shi)布的密閉(bi)盒內，酶標板(ban)加上蓋或覆(fu)膜。

4. 未使用完的酶標(biao)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biao)準(zhun)品、生物素標(biao)記抗體(ti)工作液、辣根過

氧化物酶標(biao)記親和素工作液請依據所需(xu)的量配(pei)置使用。請勿重復使用已稀(xi)釋過的標(biao)準品、生

物(wu)素(su)標記(ji)抗(kang)體工(gong)作液或、辣根過(guo)氧化物(wu)酶標記(ji)親和素(su)工(gong)作液。

5. 建議檢(jian)測(ce)樣品時均(jun)設(she)雙(shuang)孔(kong)測(ce)定，以保(bao)證檢(jian)測(ce)結果的準確性。

洗板方法

手(shou)工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪(pu)墊幾(ji)層吸水紙，

酶標板朝下(xia)用(yong)力拍幾(ji)次；將(jiang)推薦的洗滌緩(huan)沖液至少0.3ml 注入孔內(nei)，浸泡1-2 分鐘。根(gen)據需

要，重復(fu)此過程數(shu)次。

自(zi)動洗(xi)板(ban)：如果有自(zi)動洗(xi)板(ban)機，應在(zai)熟練使用后再用到(dao)正式實驗過程(cheng)中。

計(ji)算

以標(biao)(biao)準物的濃度為橫坐標(biao)(biao)(對數坐標(biao))，OD 值為縱坐標(普(pu)通坐標)，在半對數坐標紙(zhi)上

繪出標(biao)準(zhun)曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的(de)濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準

物的濃度與OD 值計(ji)算出標準(zhun)曲線的直線回歸(gui)方(fang)程式，將樣(yang)品的OD 值代(dai)入(ru)方程式，計算出

樣(yang)品(pin)濃(nong)度(du)，再(zai)乘以稀釋倍數，即為樣(yang)品(pin)的實(shi)際濃(nong)度(du)。

注意事(shi)項

1. 當混合蛋白溶液(ye)時應盡量輕緩(huan)，避免起(qi)泡(pao)。

2. 洗滌(di)(di)過(guo)程非常重要，不充分的洗滌(di)(di)易造成假陽(yang)性。

3. 一次加樣(yang)時(shi)間(jian)控(kong)制在5 分(fen)鐘(zhong)內，如標本(ben)數量多，推薦使用排槍(qiang)加樣。

4. 請每(mei)次測定的同(tong)時(shi)做標準(zhun)曲(qu)線，做復孔(kong)。

5. 如標本中待測(ce)(ce)物(wu)質含量過(guo)高，請(qing)先稀釋(shi)后(hou)再(zai)測(ce)(ce)定(ding)，計算(suan)時請(qing)zui后(hou)乘以稀釋(shi)倍(bei)數。

北京方程生(sheng)物(wu)

6. 在配(pei)制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的(de)稀釋(shi)液配(pei)制，不能混淆。

7. 底物請避光保存。

8. 不要(yao)用其它生產廠家的試(shi)劑替換試(shi)劑盒中的試(shi)劑。

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