人C肽（C-Peptide）試劑盒說明書

                                                         

預期應(ying)用

ELISA法定量測定人血清(qing)、血漿、細胞(bao)培養物上清(qing)或其它(ta)相關液(ye)體中(zhong)C-Peptide含量。

實驗原理

本(ben)試劑(ji)盒應用雙抗體夾心酶標(biao)免疫分析法測定標(biao)本(ben)中C-Peptide水(shui)平。用(yong)純(chun)化的抗(kang)體包(bao)(bao)被微(wei)孔(kong)板，制成固相抗(kang)體，往包(bao)(bao)被單(dan)抗(kang)的微(wei)孔(kong)中依次(ci)加入C-Peptide抗原、生物(wu)素化的抗人(ren)C-Peptide抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化(hua)(hua)物酶的(de)催化(hua)(hua)下(xia)(xia)轉化(hua)(hua)成藍色，并在酸的(de)作用下(xia)(xia)轉化(hua)(hua)成zui終的(de)黃色。顏色的(de)深(shen)淺和樣(yang)品中的(de)C-Peptide呈正相關。用(yong)酶標儀在450nm波長下測(ce)定吸光度（OD值），計算樣(yang)品濃度。

試劑盒組成及試劑配(pei)制

1. 酶(mei)聯(lian)板(ban)：一塊（96孔）
2. 標準品（凍干品）：2瓶(ping)，每瓶(ping)臨用前(qian)以樣品稀(xi)釋(shi)液稀(xi)釋(shi)至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反(fan)復(fu)顛倒/搓(cuo)動以(yi)助溶解，其濃(nong)度(du)為20,000 pg/mL，做系列倍比稀(xi)釋(shi)后，分別稀(xi)釋(shi)成20,000 pg/mL, 10,000 pg/mL，5,000 pg/mL ，2,500 pg/mL，1,250 pg/mL，625 pg/mL，312 pg/mL，其(qi)原(yuan)液直接(jie)作為zui高標(biao)準(zhun)濃度，樣(yang)品稀釋液直接(jie)作為標(biao)準(zhun)濃度0 pg/mL，臨用(yong)前15分(fen)鐘內配制。

如配(pei)制10,000 pg/mL標準品：取0.5ml 20,000 pg/mL的上述標準(zhun)品加入含有0.5ml樣(yang)品(pin)稀(xi)釋液的Eppendorf管(guan)中，混勻(yun)即(ji)可，其余濃度以此類推。

1. 樣品稀(xi)釋液：1×20ml/瓶。
2. 檢測稀釋液(ye)A：1×10ml/瓶。
3. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
4. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀(xi)釋，稀(xi)釋前根據預先(xian)計算(suan)好(hao)的每次實(shi)驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配(pei)制(zhi)時應(ying)多(duo)配(pei)制(zhi)0.1-0.2ml。如(ru)1ul檢測溶(rong)液A加99ul檢測(ce)稀釋液A的(de)比例(li)配(pei)制，輕(qing)輕(qing)混勻，在使用前一小(xiao)時(shi)內配(pei)制。
5. 檢測(ce)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
6. 底物(wu)溶液：1×10ml/瓶(ping)。
7. 濃(nong)洗滌(di)液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水(shui)稀釋25倍。
8. 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標本的采(cai)集及保(bao)存

1．細胞培養物上清：請(qing)離(li)心后收集上清，并將標本保存(cun)于-20℃，且(qie)應避免反復(fu)凍融。

2．血(xue)清：標本請(qing)于室溫放置(zhi)2小時或4℃一夜后于1000 x g離心20分(fen)鐘，取上清即可(ke)檢(jian)測，或將標本放于-20℃保存，但應避(bi)免反(fan)復凍融(rong)。

3．血(xue)漿：可(ke)用EDTA或肝素作(zuo)為抗(kang)凝劑，標本采集后30分鐘內(nei)于2 - 8° C 1000 x g離心15分(fen)鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避(bi)免反復(fu)凍融。

注：標本(ben)溶血(xue)會影響(xiang)zui后檢測(ce)結(jie)果，因此(ci)溶血(xue)標本(ben)不宜進行此(ci)項(xiang)檢測(ce)。

操(cao)作步驟

各(ge)試(shi)劑(ji)在使用前(qian)平衡至(zhi)室溫。實驗開始(shi)前(qian)，請提前(qian)配置好所有試(shi)劑(ji)，試(shi)劑(ji)或(huo)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)稀(xi)釋時，均需混勻(yun)，混勻(yun)時盡(jin)量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲(qu)線。如樣(yang)(yang)品(pin)(pin)濃(nong)度過(guo)高時，應在試(shi)管中將樣(yang)(yang)品(pin)(pin)用樣(yang)(yang)品(pin)(pin)稀(xi)釋液進行稀(xi)釋，以使樣(yang)(yang)品(pin)(pin)符合試(shi)劑(ji)盒(he)的檢測范圍(wei)。

1. 加樣(yang)：分別設空白孔(kong)、標準孔(kong)、待測樣品孔(kong)。空白孔(kong)加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣(qi)泡，加(jia)樣將樣品加(jia)于酶標板(ban)(ban)孔底部，盡量不觸及孔壁，輕(qing)輕(qing)晃動混(hun)勻，酶標板(ban)(ban)加(jia)上蓋或覆膜，37℃反應120分(fen)鐘。

為(wei)保證實(shi)驗(yan)(yan)結(jie)果有效(xiao)性(xing)，每(mei)次實(shi)驗(yan)(yan)請使用新的標準品(pin)溶液(ye)。

1. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取(qu)1ul檢測溶液A加99ul檢測(ce)稀(xi)釋(shi)液(ye)A的比例配(pei)制，輕(qing)輕(qing)混勻(yun)，在使用(yong)前一小(xiao)時(shi)內配(pei)制），37℃,60分鐘。
2. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體(ti)，甩干，洗板(ban)3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每(mei)孔，甩干(gan)（也可(ke)輕(qing)拍(pai)(pai)將孔內液體拍(pai)(pai)干(gan)）。
3. 每孔加檢測溶液B工作(zuo)液（同檢測(ce)A工作(zuo)液） 100ul，37℃，60分鐘。
4. 溫育(yu)60分鐘后，棄(qi)去(qu)孔(kong)內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干(gan)(gan)（也可輕(qing)拍(pai)將孔內液(ye)體拍(pai)干(gan)(gan)）。
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色(se)（30分鐘內）（此(ci)時(shi)肉眼可見標準品的前3-4孔有(you)明(ming)顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反(fan)應(ying)（此時藍色立(li)轉黃(huang)色）。終止液(ye)的(de)加(jia)入順序應(ying)盡量與(yu)底物(wu)(wu)液(ye)的(de)加(jia)入順序相(xiang)同。為(wei)了(le)保證實驗(yan)結果的(de)準確(que)性，底物(wu)(wu)反(fan)應(ying)時間(jian)到后應(ying)盡快加(jia)入終止液(ye)。
7. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的(de)光密度（OD值(zhi)）。 在加終止液后15分鐘以(yi)內進行檢測(ce)。

注：

1． 每次(ci)實驗留一孔(kong)作為空白調零孔(kong)，該孔(kong)不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測量時(shi)先用(yong)此孔調OD值至零(ling)。

2．為(wei)防止樣品蒸(zheng)發(fa)，試驗時將反應板放(fang)于(yu)鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。

3.  未使用完的(de)酶標板(ban)或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液(ye)、檢測(ce)溶液(ye)B工(gong)作液請依據所需的(de)(de)量配置(zhi)使用(yong)(yong)，不要一次(ci)用(yong)(yong)完。請勿重(zhong)復使用(yong)(yong)已稀釋過的(de)(de)標準(zhun)品、檢測溶液A工(gong)作液(ye)或檢測溶(rong)液(ye)B工(gong)作液(ye)。

4.  建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙，酶標板朝下(xia)用(yong)力(li)拍幾次；將推(tui)薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入(ru)孔內，浸泡1-2分(fen)鐘，根據需

要，重復(fu)此過程數次。
自動(dong)洗板：如果有(you)自動(dong)洗板機(ji)，應在(zai)熟練使用后(hou)再(zai)用到正式實驗過程(cheng)中(zhong)。

特(te)異性

    本(ben)試劑盒可同時檢測重組(zu)或天然的人C-Peptide，且與其(qi)它相關蛋白無(wu)交(jiao)叉反應(ying)。

計算

  以標(biao)準(zhun)物(wu)的濃度為橫坐標(biao)（對數(shu)坐標(biao)），OD值為縱(zong)坐(zuo)標（普通坐(zuo)標），在半對(dui)數坐(zuo)標紙上(shang)繪(hui)出標準曲(qu)線(xian)，根據樣(yang)品的(de)OD值由標準曲線查出(chu)相應(ying)的濃(nong)度(du)；再(zai)乘以(yi)稀釋倍數；或用標準物的濃(nong)度(du)與OD值計算(suan)出標準曲線的直線回歸方(fang)程式，將(jiang)樣品的OD值代入(ru)方(fang)程(cheng)式，計算出樣(yang)品濃度，再乘以稀釋倍數(shu)，即為(wei)樣(yang)品的實際濃度。

注(zhu)意事項

1. 洗滌過程非常重要，不(bu)充分的(de)洗滌易造成(cheng)假陽性(xing)。
2. 一次加樣時(shi)間控制在5分(fen)鐘內(nei)，如(ru)標本數量多(duo)，推薦使用排槍(qiang)加樣。
3. 請每(mei)次測(ce)定的同時做標準曲線，做復孔。
4. 如標本(ben)中(zhong)待測物(wu)質含量過高，請先稀釋后(hou)再測定，計算時請zui后(hou)乘(cheng)以稀釋倍(bei)數。

5．在配制(zhi)標準品、檢測溶液工作液時，請(qing)以(yi)相應(ying)的稀釋液配制(zhi)，不能混淆。

6．底物(wu)請避光保存(cun)。

檢測范圍(wei)：

312 pg/mL -20,000 pg/mL

說明

1．試(shi)劑盒(he)保(bao)存：-20℃（較長時間不(bu)用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．有效期(qi)：6個月

3．濃(nong)洗滌液會有(you)鹽(yan)析(xi)出(chu)，稀釋時可在(zai)水浴中加溫助溶(rong)。

4．剛開啟的酶聯板孔中可能會(hui)含有少(shao)許水樣物質(zhi)，此(ci)為正常現象，不會(hui)對實驗結果造(zao)成任何影響。

5．中、英(ying)文說(shuo)明書可能(neng)會有不一(yi)致之(zhi)處，請(qing)以(yi)英(ying)文說(shuo)明書為準(zhun)。