小(xiao)鼠IL-23 ELISA試劑(ji)盒使用說明書

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本(ben)試劑盒僅(jin)供研究使(shi)用

預期應用

ELISA法定量測定小鼠血清(qing)、血漿、細胞培養物上清(qing)或(huo)其(qi)它相關液體中IL-23含量。

實(shi)驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾(jia)心酶標(biao)免(mian)疫分析法測定標(biao)本中IL-23水平。用純化的抗體包被(bei)(bei)微(wei)孔板，制成(cheng)固相抗體，往(wang)包被(bei)(bei)單抗的微(wei)孔中依(yi)次(ci)加入IL-23抗原、生物素化的抗小(xiao)鼠(shu)IL-23抗體、HRP標(biao)記的親和(he)素，經過*洗滌后用(yong)底物TMB顯色。TMB在(zai)過氧化物酶的(de)催化下轉(zhuan)化成藍色，并在(zai)酸的(de)作用(yong)下轉(zhuan)化成zui終的(de)黃色。顏色的(de)深淺和樣(yang)品(pin)中的(de)IL-23呈正(zheng)相關(guan)。用(yong)酶標儀在(zai)450nm波長下測定(ding)吸光(guang)度(du)（OD值），計算(suan)樣(yang)品(pin)濃度(du)。

試劑(ji)(ji)盒組成及試劑(ji)(ji)配制(zhi)

1. 酶聯板：一塊(kuai)（96孔(kong)）
2. 標準品（凍(dong)干品(pin)）：2瓶，每瓶臨(lin)用(yong)前(qian)以(yi)樣品(pin)稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)(shi)液(ye)稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)(shi)至1ml，蓋好后靜置10分(fen)鐘(zhong)以(yi)上(shang)，然后反復(fu)顛(dian)倒/搓動以(yi)助溶解，其(qi)濃度為(wei)10000 pg/mL，做系列倍比稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)(shi)后，分(fen)別稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)(shi)成10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，312.5 pg/mL，156 pg/mL，其(qi)原液(ye)直(zhi)接作為(wei)zui高(gao)標準濃度，樣品(pin)稀(xi)釋(shi)(shi)(shi)(shi)液(ye)直(zhi)接作為(wei)標準濃度0 pg/mL，臨(lin)用(yong)前(qian)15分(fen)鐘(zhong)內配制。

如(ru)配制5000 pg/mL標(biao)準品(pin)：取0.5ml 10000 pg/mL的(de)上述標(biao)準品(pin)加(jia)入含有0.5ml樣品(pin)稀釋液(ye)的(de)Eppendorf管中，混勻即(ji)可(ke)，其余濃度(du)以(yi)此類推。

1. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
2. 檢測(ce)稀(xi)釋液(ye)A：1×10ml/瓶。
3. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
4. 檢(jian)測溶(rong)液(ye)A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
5. 檢測溶(rong)液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
6. 底物(wu)溶液：1×10ml/瓶。
7. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
8. 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標本的采集及保存

1．細(xi)胞培養物(wu)上(shang)清：請離心(xin)后收集上(shang)清，并將標本(ben)保存于-20℃，且應避免反復凍融。

2．血清：標本請于室溫放置2小時(shi)或4℃一夜后于1000 x g離心(xin)20分鐘，取上清即可檢測(ce)，或將標本放于-20℃保存，但應避(bi)免反復凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作(zuo)為抗凝(ning)劑，標(biao)本采集后30分鐘內于(yu)2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保(bao)存，但應(ying)避免(mian)反(fan)復凍融。

注(zhu)：標本(ben)溶血(xue)會影響zui后檢測結果，因此(ci)溶血(xue)標本(ben)不宜進行此(ci)項檢測。

操作(zuo)步驟

各試(shi)劑在使用前(qian)平衡至室溫。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標板加上蓋，37℃反應120分鐘。
2. 棄去(qu)液體，甩干，不(bu)用洗滌。
3. 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
4. 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分(fen)鐘，洗板(ban)5次，甩(shuai)干(gan)。
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見(jian)標準品(pin)的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不(bu)明顯）。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時蘭色立轉黃色）。用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測量時先用此孔調OD值至零。

2．為(wei)防止樣品蒸發，試(shi)驗(yan)時將(jiang)反應板放于鋪有濕布的密(mi)閉盒內。

洗(xi)板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試(shi)劑(ji)盒可同時檢測重組(zu)或(huo)天然的(de)小鼠IL-23，且與(yu)其它相關蛋白無交叉反應(ying)。

計算

  以標(biao)(biao)準物(wu)的(de)(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)為(wei)橫坐(zuo)標(biao)(biao)（對(dui)數(shu)坐(zuo)標(biao)(biao)），OD值為(wei)縱(zong)坐(zuo)標(biao)(biao)（普通(tong)坐(zuo)標(biao)(biao)），在半(ban)對(dui)數(shu)坐(zuo)標(biao)(biao)紙上繪出(chu)(chu)標(biao)(biao)準曲線，根據樣品(pin)的(de)(de)(de)OD值由標(biao)(biao)準曲線查出(chu)(chu)相應(ying)的(de)(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)；再乘以稀釋倍數(shu)；或用標(biao)(biao)準物(wu)的(de)(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)與OD值計(ji)算出(chu)(chu)標(biao)(biao)準曲線的(de)(de)(de)直線回歸方程(cheng)式，將樣品(pin)的(de)(de)(de)OD值代(dai)入方程(cheng)式，計(ji)算出(chu)(chu)樣品(pin)濃(nong)(nong)度(du)，再乘以稀釋倍數(shu)，即為(wei)樣品(pin)的(de)(de)(de)實際濃(nong)(nong)度(du)。

注(zhu)意事項

1. 洗(xi)滌過程非常重要，不充分的(de)洗(xi)滌易造成(cheng)假陽性。
2. 一次加樣時間(jian)控(kong)制在5分鐘(zhong)內，如(ru)標本數量(liang)多，推薦使(shi)用排(pai)槍加樣。
3. 請每次(ci)測定的同時做標準曲線(xian)，做復(fu)孔。
4. 如標本(ben)中待測物質(zhi)含(han)量過高，請(qing)先稀釋后再測定(ding)，計算時請(qing)zui后乘以(yi)稀釋倍數(shu)。

5．在配(pei)制標準(zhun)品、檢測溶液工作(zuo)液時，請以相應的稀釋(shi)液配(pei)制，不能混(hun)淆。

6．底(di)物請避光保(bao)存。

說明

1．試劑盒保存(cun)：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．有效(xiao)期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀(xi)釋時可在水浴中加溫助溶。

4．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有(you)少許水樣物質，此為正常現象，不會對實(shi)驗結果造成任何(he)影響。

5．中、英文說明書可能會(hui)有(you)不一致之處(chu)，請以(yi)英文說明書為(wei)準(zhun)。