人心型脂(zhi)肪酸結合蛋(dan)白(bai)(h-FABP)酶聯(lian)免疫分(fen)析試劑盒

使用說明書

本試劑盒僅供體外研究使用!

預期應(ying)用

ELISA法(fa)定量測定人(ren)血清、血漿或其它相關生物液體(ti)中心(xin)型脂肪酸結合蛋白(bai)(h-FABP)含(han)量。

實(shi)驗(yan)原理(li)

用純(chun)化的抗體包(bao)被微孔板，制(zhi)成固(gu)相載體，往包(bao)被抗  h-FABP抗(kang)體的(de)微孔中依(yi)次加(jia)入標本或標準品、生(sheng)物素化的(de)抗(kang)  h-FABP抗體、HRP標記的(de)親和素，經(jing)過*洗滌后(hou)用底(di)物  TMB顯色。TMB在過氧化(hua)物酶的催化(hua)下轉化(hua)成藍色，并在酸的作(zuo)用下轉化(hua)成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 h-FABP呈正相關(guan)。用酶(mei)標儀在450nm波(bo)長下測定(ding)吸光(guang)度(du)（ OD值），計(ji)算樣品濃度。

試劑(ji)盒(he)組成及試劑(ji)配制

1. 酶聯板(ban)：一塊（96孔）
2. 標準品（凍(dong)干品）： 2瓶，每(mei)瓶臨用前以樣品稀釋(shi)液稀釋(shi)至1ml，蓋好(hao)后靜置10分鐘以(yi)上，然后(hou)反(fan)復顛(dian)倒/搓動以助溶解，其濃度為150 ng/ml，請先稀釋至(zhi)30 ng/ml，再做系(xi)列倍比稀釋(注：不要直接在板中進行倍比稀(xi)釋)后(hou)，分別稀釋成30 ng/ml，15 ng/ml，7.5 ng/ml，3.75 ng/ml，1.88 ng/ml，0.94 ng/ml，0.47 ng/ml，樣品稀(xi)釋液(ye)直接作為(wei)標準濃度0 ng/ml，臨用前(qian)15分鐘內配制。如配制15 ng/ml標準品：取0.5ml (不要(yao)少于0.5ml ) 30 ng/ml的上述標準品加入含有(you)0.5ml樣(yang)品稀釋液的Eppendorf管中，混勻(yun)即可(ke)，其余濃(nong)度(du)以此類(lei)推(tui)。
3. 樣品稀釋液：1×20ml。
4. 檢測稀(xi)釋液A：1×10ml。
5. 檢測稀釋液(ye)B：1×10ml。
6. 檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(ju)預先計(ji)算好的每(mei)次實驗所需(xu)的總(zong)量(liang)配制（100μl/孔），實際配(pei)制(zhi)時應多(duo)配(pei)制(zhi)  0.1-0.2ml。如(ru)10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制(zhi)，輕輕混勻，在(zai)使用前一小時內配制(zhi)。
7. 檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方(fang)法同檢(jian)測溶液(ye)A。
8. 底物溶(rong)液(ye)：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用(yong)時(shi)每瓶用(yong)蒸餾水(shui)稀(xi)釋25倍。
10. 終止(zhi)液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。
11. 覆膜：5張
12. 使(shi)用說明書：1份

自備物品(pin)

1.   酶標儀（建(jian)議參考儀器使用(yong)說明提前預熱(re)）

2.   微量(liang)加液器及(ji)吸頭(tou)，EP管

3.   蒸餾水或去離子(zi)水，全新(xin)濾紙

標本的(de)采集(ji)及保存

1. 血清：全血標本請于室(shi)溫放置2小時(shi)或4℃一夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即(ji)可檢測，或將標本(ben)放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復(fu)凍融(rong)。
2. 血(xue)漿：可用(yong)EDTA或肝素(su)作(zuo)為抗(kang)凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biao)本(ben)放(fang)于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免(mian)反復凍融(rong)。
3. 其它(ta)生物(wu)標(biao)本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(ce)，或將標本放于-20℃或(huo)-80℃保存，但(dan)應避(bi)免反復凍融。

注：以上標本置4℃保存應小于1周，-20℃或-80℃均應密封(feng)保存，-20℃不應(ying)超(chao)過(guo)1個(ge)月(yue)，-80℃不應(ying)超過2個月；標(biao)本溶血(xue)會影(ying)響zui后檢測結果，因此溶血(xue)標(biao)本不宜進(jin)行此項檢測。

操作步驟

實驗開始前(qian)，各試(shi)劑均應平衡至室溫（試(shi)劑不能直(zhi)接在37℃溶解）；試(shi)  劑或樣(yang)品稀(xi)釋(shi)時，均(jun)需混勻(yun)，混勻(yun)時盡量避(bi)免起泡。實驗前應(ying)預測樣(yang)品含量，如樣(yang)品濃度過高時，應(ying)對(dui)樣(yang)品進(jin)行(xing)稀(xi)釋(shi)，以使稀(xi)釋(shi)后(hou)的樣(yang)品符合試劑盒的檢測范(fan)圍，計算(suan)時再乘以相應(ying)的稀(xi)釋(shi)倍數。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品(pin)(pin)孔。空白孔加樣品(pin)(pin)稀釋液 100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡(pao)，加(jia)樣將樣品加(jia)于酶標板(ban)孔底(di)部，盡量不觸及孔壁，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)晃(huang)動混勻，酶標板(ban)加(jia)上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體(ti)，甩干(gan)，不(bu)用(yong)洗滌。每孔(kong)加  檢測溶液A工(gong)作液(ye) 100μl（在使用前(qian)一(yi)小時(shi)內配制），酶標板(ban)加上覆(fu)膜, 37℃反應60分鐘。
3. 溫育60分鐘后(hou)，棄去孔(kong)內(nei)液體，甩(shuai)干，洗板(ban) 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕(qing)拍將孔內液(ye)體拍干）。
4. 每孔加檢測溶液B工作液(ye)（同檢測A工作液） 100μl，酶標(biao)板加上覆膜37℃反應60分鐘。
5. 溫育(yu)60分(fen)鐘后(hou)，棄去(qu)孔內液體，甩(shuai)干，洗(xi)板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體(ti)拍干）。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆(fu)膜37℃避光顯色（30分(fen)鐘內，此時(shi)肉眼可見標準(zhun)品的前3-4孔(kong)有(you)明顯的梯度蘭色，后3-4孔(kong)梯(ti)度不明顯，即可終(zhong)止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終(zhong)止(zhi)反(fan)應(ying)，此時藍色立轉黃色。終(zhong)止(zhi)液的加入順(shun)序應(ying)盡(jin)(jin)量與底物液的加入順(shun)序相(xiang)同。為了保證實驗結果的準(zhun)確(que)性，底物反(fan)應(ying)時間(jian)到后(hou)應(ying)盡(jin)(jin)快加入終(zhong)止(zhi)液。
8. 用酶聯儀在(zai)450nm波(bo)長依序測(ce)量各孔的光(guang)密度(du)（OD值(zhi)）。 在加終止(zhi)液后(hou)立即進行(xing)檢測。

注(zhu)：

1.  試劑(ji)準備：所(suo)有試劑都必(bi)須在(zai)使用(yong)前達到室(shi)溫，使用(yong)后請(qing)立即(ji)按照說明書要求保存試劑。  實(shi)驗操作中(zhong)請(qing)使用一次性的吸頭，避免交叉污染(ran)。

2.   加樣(yang)：加(jia)樣或(huo)加(jia)試劑時，請(qing)注意在吸取標本 / 標(biao)準(zhun)品，酶結(jie)合物(wu)或底物(wu)時，*個(ge)孔(kong)(kong)與zui后(hou)一個(ge)孔(kong)(kong)加樣之間的時間間隔如(ru)果太(tai)大，將會導致不同的 “預孵育(yu)”時間，從(cong)而明顯地影響到測量(liang)值的準(zhun)確性及(ji)重(zhong)復性。一次加樣(yang)(yang)時間(jian)（包括標準品(pin)及所有(you)樣(yang)(yang)品(pin)）控制(zhi)在  10分鐘(zhong)內，如標本數(shu)量多(duo)，推薦使用(yong)多(duo)道移(yi)液器加樣。

3.   孵育：為防止(zhi)樣(yang)品蒸發，試驗(yan)時(shi)將反應板(ban)放于(yu)鋪有濕(shi)布的(de)密閉盒內，酶標板(ban)加(jia)上蓋或覆(fu)膜，以避(bi)(bi)免(mian)液體蒸發；洗板(ban)后應盡快進行下(xia)步(bu)操作，任何時(shi)侯都應避(bi)(bi)免(mian)酶標板(ban)處于(yu)干(gan)燥狀(zhuang)態(tai);同(tong)時應(ying)嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。

4.   洗滌：洗滌(di)過程中(zhong)反(fan)應孔(kong)中(zhong)殘留的洗滌(di)液(ye)應在濾紙上充(chong)分拍干，勿(wu)將濾紙直接放入反(fan)應孔(kong)中(zhong)吸水，同時要(yao)消除板底(di)殘留的液(ye)體(ti)和手(shou)指印，避免影(ying)響zui后的酶(mei) 標儀(yi)讀數。

5.  試(shi)劑配制：Detection A及Detection B在使用(yong)前(qian)請手甩幾下或少時離心處理，以(yi)使管(guan)壁或瓶蓋(gai)的液(ye)體(ti)沉積(ji)到管(guan)底。標準品、檢測溶液(ye)A工作液、檢測溶液B工作液(ye)請依據(ju)所需(xu)的量配(pei)(pei)置(zhi)使用，并(bing)使用相應的稀釋液(ye)配(pei)(pei)制(zhi)，不(bu)能(neng)混淆。請配(pei)(pei)置(zhi)標(biao)準(zhun)品(pin)及工作液(ye)，盡(jin)量不(bu)要微量配(pei)(pei)置(zhi)（如(ru)吸取檢測溶液(ye)A時，一次不要小于(yu)10μl），以避(bi)免(mian)由于不準確稀釋而造成的(de)濃度誤差；請(qing)勿重復使(shi)用已稀釋過的(de)標(biao)準品、檢測溶(rong)液A工(gong)作液或檢測溶液B工作液。

6.  反應時(shi)間的控制：加入底(di)物(wu)后請定時觀察反應孔(kong)的(de)顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較(jiao)深(shen)，請提(ti)前加入終止液終止反(fan)(fan)應(ying)(ying)，避免反(fan)(fan)應(ying)(ying)過強從而影響酶(mei)標儀光(guang)密度讀數。

7.  底物：底物(wu)請避(bi)光(guang)保(bao)存，在儲存和溫育(yu)時避(bi)免強光(guang)直接照射。

    建議檢測樣(yang)品時均設雙(shuang)孔測定，以保(bao)證檢測結果的準確(que)性。

    如標(biao)本中待測(ce)物質含量(liang)過高(gao)，請先稀釋后(hou)再測(ce)定，計算時請zui后(hou)乘以稀釋倍(bei)數。

洗(xi)板方法

1.  手工洗(xi)板(ban)方法：吸(xi)去（不可(ke)觸及(ji)板(ban)壁(bi)）或甩掉(diao)酶標板(ban)內的液(ye)體(ti)；在實驗臺上鋪墊幾(ji)層(ceng)吸(xi)水紙，酶標板(ban)朝下用力拍幾(ji)次；將推薦的洗(xi)滌緩沖液(ye)至少0.3ml注入孔內(nei)，浸泡(pao)1-2分鐘，根據需要，重(zhong)復此(ci)過(guo)程數次。

2.  自(zi)動(dong)洗(xi)板(ban)：如果有自(zi)動(dong)洗(xi)板(ban)機，應在熟練(lian)使用后再用到正式實驗過程中。

特異性(xing)

    本試劑盒可同時(shi)檢(jian)測(ce)重(zhong)組或(huo)天(tian)然的(de)人h-FABP，且與其(qi)它相關(guan)蛋(dan)白無交叉反應。

計算

  以標(biao)準(zhun)物的濃度為縱坐標(biao)（對數坐標(biao)）， OD值為橫(heng)坐(zuo)標(biao)（對數坐(zuo)標(biao)），在對數坐(zuo)標(biao)紙上繪出標(biao)準曲線。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據樣品(pin)的OD值由標(biao)準(zhun)曲線查出相(xiang)應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標(biao)準(zhun)物的濃度與 OD值計算出(chu)標準(zhun)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方(fang)程式，計(ji)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shu)，即為樣品的實際濃度。

檢測范圍：0.312 ng/ml-20 ng/ml

靈敏(min)度(du)：0.078 ng/ml