小鼠胃(wei)泌(mi)素(Gastrin)ELISA試(shi)劑盒說(shuo)明書(shu)

本試劑(ji)盒僅(jin)供研究(jiu)使(shi)用

檢測(ce)范圍：1.25 pg/ml-80 pg/ml

zui低檢測限：0.31 pg/ml

特異性：本(ben)試劑盒可同時(shi)檢測天(tian)然(ran)或重(zhong)組的小鼠胃泌(mi)素，且與其他相關蛋白無交叉反(fan)應。

有效期：6個月

預期(qi)應用(yong)：ELISA法定(ding)量測定(ding)小(xiao)鼠血清、血漿、細(xi)胞培(pei)養(yang)上清或其它相關生(sheng)物液體(ti)中胃(wei)泌素(su)含(han)量。

說(shuo)明

1. 試劑盒保存：-20℃（較長時間不用(yong)時）；2-8℃（頻繁使用(yong)時）。
2. 濃洗滌液低溫保(bao)存(cun)會(hui)有鹽析(xi)出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3. 中、英文(wen)說明書可能會有不一致之處，請(qing)以英文(wen)說明書為準。
4. 剛開啟(qi)的酶聯(lian)板孔(kong)中可(ke)能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響(xiang)。

實驗原(yuan)理

用純化的(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)包被(bei)微孔板，制成固(gu)相載體(ti)，往包被(bei)抗(kang)(kang)(kang)胃泌素抗(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的(de)抗(kang)(kang)(kang)胃泌素抗(kang)(kang)(kang)體(ti)、HRP標記的(de)親和(he)素(su)，經過(guo)*洗滌后用(yong)底物TMB顯色(se)。TMB在過(guo)氧化物酶的(de)(de)催化下(xia)轉(zhuan)化成藍色(se)，并在酸的(de)(de)作用(yong)下(xia)轉(zhuan)化成zui終的(de)(de)黃(huang)色(se)。顏(yan)色(se)的(de)(de)深淺和樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)(de)胃泌素呈(cheng)正(zheng)相關(guan)。用(yong)酶標儀在450nm波長(chang)下(xia)測(ce)定吸光度（OD值），計算(suan)樣(yang)品(pin)濃度。

試(shi)(shi)劑(ji)盒組成(cheng)及(ji)試(shi)(shi)劑(ji)配制

1. 酶聯板(ban)(Assay plate )：                                 一塊(kuai)（96孔）。
2. 標準品(pin)（Standard）：                  ;               2瓶(凍干品(pin))。
3. 樣品稀釋(shi)液(Sample Diluent)：                           1×20ml/瓶。
4. 生物素標記抗體(ti)稀釋液(ye)（Biotin-antibody Diluent）：         1×10ml/瓶(ping)。
5. 辣根(gen)過(guo)氧(yang)化(hua)物酶(mei)標記親和素稀釋(shi)液 （HRP-avidin Diluent）： 1×10ml/瓶。
6. 生物素標(biao)記抗體(ti)（Biotin-antibody）：             1×120μl/瓶（1：100）。
7. 辣根(gen)過氧化物酶標(biao)記親和(he)素（HRP-avidin）：   ;   1×120μl/瓶（1：100）。
8. 底物(wu)溶液（TMB Substrate）：                            1×10ml/瓶。
9. 濃(nong)洗滌液(ye)（Wash Buffer）： 1×20ml/瓶，使用(yong)時每瓶用(yong)蒸餾水稀釋25倍(bei)。
10. 終止液（Stop Solution）：                    1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供(gong)的試劑和器材(cai)

1. 標(biao)準規(gui)格酶標(biao)儀
2. 高(gao)速離心(xin)機
3. 電熱恒溫培養箱
4. 干凈的(de)試管(guan)和Eppendof管(guan)
5. 系列可調節(jie)移液(ye)器(qi)及吸頭，一次檢測樣(yang)品較多時(shi)，用多通道移液(ye)器(qi)

6.  蒸餾水，容量瓶等

標本的采集(ji)及保(bao)存(cun)

1. 血(xue)清：全血(xue)標本請(qing)于(yu)室溫放置2小時或4℃一夜(ye)后(hou)于(yu)1000g離心20分(fen)鐘(zhong)，取上清即(ji)可檢測，或將標(biao)本放于-20℃或(huo)-80℃保存，但(dan)應避(bi)免反復凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本(ben)采集(ji)后30分(fen)鐘內于2 - 8°C 1000 g離心(xin)15分鐘，或將(jiang)標本放于-20℃或(huo)-80℃保存，但應(ying)避免反復凍融(rong)。
3. 細胞培養物上清或其它生物標本(ben)：1000g離心20分鐘，取(qu)上清即可檢(jian)測，或將標(biao)本放于-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但(dan)應避(bi)免反復凍融。

注：標本(ben)溶(rong)血(xue)會影響zui后(hou)檢(jian)測(ce)結果，因此溶(rong)血(xue)標本(ben)不宜進(jin)行此項檢(jian)測(ce)。

標(biao)本(ben)的稀釋原則(ze)：

首先通過文獻檢索的(de)(de)方式(shi)了解待測(ce)樣本的(de)(de)大(da)致含(han)量，確(que)定適當(dang)的(de)(de)稀(xi)釋(shi)倍(bei)數。只有稀(xi)釋(shi)至(zhi)標準(zhun)曲線的(de)(de)范圍內，檢測(ce)的(de)(de)結果才是準(zhun)確(que)的(de)(de)。稀(xi)釋(shi)的(de)(de)過程(cheng)中，應做好(hao)詳細的(de)(de)記錄。zui后計算(suan)濃度時，稀(xi)釋(shi)了“N”倍(bei)，標本的(de)(de)濃度應再(zai)乘以“N”。

標準品(pin)的稀釋原則(ze)：2瓶，每瓶臨(lin)用前以樣品(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)至1ml，蓋好后靜置10分(fen)鐘以上，然后反復顛(dian)倒/搓(cuo)動以助溶解，其(qi)濃度為(wei)400 pg/ml，做系列倍比稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)后，分(fen)別(bie)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)400 pg/ml, 200 pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12.5 pg/ml, 6.25 pg/ml.，樣品(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)直(zhi)接作為(wei)標準濃度0 pg/ml，臨(lin)用前15分(fen)鐘內(nei)配制。

如(ru)配制200 pg/ml標(biao)準品：取0.5ml（不要(yao)少于0.5ml）400 pg/ml的上述標(biao)準品加入含0.5ml樣(yang)品稀(xi)釋液(ye)的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lei)推。

生物素標記(ji)抗體的稀釋原則(ze)：

臨用前以生(sheng)物(wu)素標記抗(kang)(kang)(kang)體稀(xi)釋(shi)液(ye)稀(xi)釋(shi)，稀(xi)釋(shi)前根據預先計算好的每(mei)次(ci)實驗所需的總量配(pei)制(zhi)(zhi)（每(mei)孔100μl），實際配(pei)制(zhi)(zhi)時應(ying)多(duo)配(pei)制(zhi)(zhi)0.1-0.2ml。如(ru)10μl生(sheng)物(wu)素標記抗(kang)(kang)(kang)體加990μl生(sheng)物(wu)素標記抗(kang)(kang)(kang)體稀(xi)釋(shi)液(ye)的比(bi)例配(pei)制(zhi)(zhi)，輕(qing)輕(qing)混(hun)勻，在(zai)使用前一小(xiao)時內配(pei)制(zhi)(zhi)。

辣根過氧(yang)化(hua)物酶(mei)標記親(qin)和素(su)的稀釋原則：

臨(lin)用前以辣根(gen)過(guo)(guo)氧化(hua)物(wu)酶(mei)標(biao)記(ji)(ji)親和素(su)稀(xi)釋(shi)液(ye)稀(xi)釋(shi)，稀(xi)釋(shi)前根(gen)據預先計算(suan)好的每次實驗所需(xu)的總量(liang)配(pei)(pei)制(zhi)（每孔100μl），實際配(pei)(pei)制(zhi)時應多(duo)配(pei)(pei)制(zhi)0.1-0.2ml。如10μl辣根(gen)過(guo)(guo)氧化(hua)物(wu)酶(mei)標(biao)記(ji)(ji)親和素(su)加(jia)990μl辣根(gen)過(guo)(guo)氧化(hua)物(wu)酶(mei)標(biao)記(ji)(ji)親和素(su)稀(xi)釋(shi)液(ye) 的比例配(pei)(pei)制(zhi)，輕輕混勻，在(zai)使用前一小時內配(pei)(pei)制(zhi)。

操(cao)作(zuo)步驟

實驗開(kai)始前，請提前配置好所有試劑(ji)(ji)，試劑(ji)(ji)或樣(yang)品稀釋時，均需混勻(yun)(yun)，混勻(yun)(yun)時盡(jin)量避(bi)免起泡。每(mei)次檢測都應該做標準曲線。如(ru)樣(yang)品濃度(du)過高時，用樣(yang)品稀釋液進行稀釋，以使樣(yang)品符合試劑(ji)(ji)盒的檢測范圍。

1. 加(jia)(jia)樣：分(fen)別(bie)(bie)設空白孔(kong)(kong)、標(biao)準孔(kong)(kong)、待(dai)(dai)測樣品(pin)孔(kong)(kong)。空白孔(kong)(kong)加(jia)(jia)樣品(pin)稀釋液100μl，余(yu)孔(kong)(kong)分(fen)別(bie)(bie)加(jia)(jia)標(biao)準品(pin)或待(dai)(dai)測樣品(pin)100μl，注意不要有(you)氣泡，加(jia)(jia)樣將(jiang)樣品(pin)加(jia)(jia)于(yu)酶標(biao)板孔(kong)(kong)底部，盡(jin)量(liang)不觸及(ji)孔(kong)(kong)壁，輕輕晃(huang)動(dong)混勻，酶標(biao)板加(jia)(jia)上蓋或覆膜，37℃反應120分(fen)鐘。

為(wei)保證實驗結果(guo)有效性，每次實驗請(qing)使用新的標(biao)準品溶液。

1. 棄去(qu)液(ye)體(ti)(ti)，甩干(gan)，不用(yong)洗滌。每孔加生物(wu)(wu)素(su)標(biao)記(ji)抗體(ti)(ti)工作液(ye) 100μl（取1μl生物(wu)(wu)素(su)標(biao)記(ji)抗體(ti)(ti)加99μl生物(wu)(wu)素(su)標(biao)記(ji)抗體(ti)(ti)稀釋液(ye)的比例(li)配制，輕(qing)輕(qing)混勻，在使用(yong)前一小時內配制），37℃,60分(fen)鐘。
2. 溫育(yu)60分鐘后，棄(qi)去孔內液體(ti)，甩干，洗板3次(ci)(ci)，每次(ci)(ci)浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
3. 每(mei)孔加辣(la)根過(guo)氧化物酶標記親(qin)和素工作(zuo)液（同(tong)生物素標記抗體工作(zuo)液） 100μl，37℃，60分鐘。
4. 溫(wen)育(yu)60分鐘(zhong)后，棄去孔內液體，甩(shuai)干，洗(xi)板5次，每(mei)次浸(jin)泡1-2分鐘(zhong)，200μl/每(mei)孔，甩(shuai)干。
5. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。
6. 依序(xu)每孔加終止(zhi)溶液(ye)(ye)50μl，終止(zhi)反應（此時(shi)藍色立轉黃色）。終止(zhi)液(ye)(ye)的加入(ru)順序(xu)應盡量與底物液(ye)(ye)的加入(ru)順序(xu)相同。為了保證實(shi)驗結果(guo)的準確性，底物反應時(shi)間到(dao)后應盡快(kuai)加入(ru)終止(zhi)液(ye)(ye)。
7. 用酶聯儀在450nm波長依(yi)序測(ce)量各孔的光密度(du)（OD值）。 在加終止液后15分鐘以(yi)內進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)。

實驗(yan)備注

1. 用戶在初(chu)次使用試劑(ji)(ji)盒時，應將各種試劑(ji)(ji)管(guan)離(li)心數分鐘，以便試劑(ji)(ji)集(ji)中(zhong)到管(guan)底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
3. 為(wei)防(fang)止(zhi)樣品蒸發，試驗時將反應板(ban)(ban)放于鋪有濕(shi)布(bu)的密閉盒內(nei)，酶標(biao)板(ban)(ban)加上(shang)蓋或覆膜。
4. 未使用(yong)完的(de)酶標(biao)(biao)板(ban)或者試劑，請(qing)于2-8℃保存。標(biao)(biao)準品、生物素(su)標(biao)(biao)記(ji)抗體(ti)工(gong)作(zuo)液(ye)、辣根過(guo)氧化物酶標(biao)(biao)記(ji)親和素(su)工(gong)作(zuo)液(ye)請(qing)依據所需的(de)量配置使用(yong)。請(qing)勿重復使用(yong)已稀釋過(guo)的(de)標(biao)(biao)準品、生物素(su)標(biao)(biao)記(ji)抗體(ti)工(gong)作(zuo)液(ye)、或辣根過(guo)氧化物酶標(biao)(biao)記(ji)親和素(su)工(gong)作(zuo)液(ye)。
5. 建議檢測樣品時均(jun)設雙孔測定(ding)，以保(bao)證檢測結(jie)果的(de)準確性(xing)。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算(suan)

以標(biao)(biao)(biao)準物的(de)濃(nong)度(du)(du)(du)為(wei)橫坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)(biao)（對(dui)數(shu)坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)(biao)），OD值為(wei)縱坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)(biao)（普通(tong)坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)(biao)），在半(ban)對(dui)數(shu)坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)(biao)紙上繪出(chu)標(biao)(biao)(biao)準曲線，根(gen)據樣品的(de)OD值由標(biao)(biao)(biao)準曲線查出(chu)相(xiang)應的(de)濃(nong)度(du)(du)(du)；再乘以稀釋倍數(shu)；或用標(biao)(biao)(biao)準物的(de)濃(nong)度(du)(du)(du)與OD值計(ji)算(suan)出(chu)標(biao)(biao)(biao)準曲線的(de)直線回(hui)歸方(fang)程式，將(jiang)樣品的(de)OD值代入方(fang)程式，計(ji)算(suan)出(chu)樣品濃(nong)度(du)(du)(du)，再乘以稀釋倍數(shu)，即為(wei)樣品的(de)實際濃(nong)度(du)(du)(du)。

注意事(shi)項

1. 當混合蛋白溶液時應(ying)盡量(liang)輕緩，避免起(qi)泡。
2. 洗滌過程非常重(zhong)要，不充分的洗滌易造成假(jia)陽性。
3. 一次加(jia)(jia)樣(yang)時間控制在5分鐘內，如(ru)標本數(shu)量多，推薦使用排槍加(jia)(jia)樣(yang)。
4. 請每次測定的同時做(zuo)標準曲線，做(zuo)復孔。
5. 如(ru)標本(ben)中(zhong)待測物質含(han)量過(guo)高(gao)，請先稀(xi)釋(shi)后再測定，計算時(shi)請zui后乘以稀(xi)釋(shi)倍(bei)數。
6. 在配(pei)制(zhi)標準品、檢(jian)測溶(rong)液工作液時，請以(yi)相(xiang)應的稀釋(shi)液配(pei)制(zhi)，不能混淆。
7. 底物請避(bi)光保存。
8. 不要用其它生產廠家的試(shi)劑替換試(shi)劑盒(he)中的試(shi)劑。