牛血清白蛋白的(de)鑒定(ding)

實驗(yan)目的：

通(tong)過牛血清清蛋(dan)白的(de)提取與鑒定，掌握(wo)鹽(yan)析、離心(xin)、透析、電泳、及(ji)(ji)呈色(se)反應的(de)原理及(ji)(ji)應用(yong)。

實驗原(yuan)理(li)：

   應(ying)用(yong)相同濃度硫酸銨反復鹽析法，將血(xue)清中的清蛋白(bai)(bai)與其他球蛋白(bai)(bai)分離(li)，再利(li)(li)用(yong)透析法除鹽，即可提取清蛋白(bai)(bai)。再利(li)(li)用(yong)電泳技術(shu)，即可對(dui)牛(niu)血(xue)清清蛋白(bai)(bai)進行分離(li)與鑒(jian)定。

實驗步驟：

1.鹽(yan)析  取(qu)離心管一支加(jia)入牛血清待測液(ye)2 ml、加(jia)入等量PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）稀釋血清，搖勻(yun)后(hou)，逐(zhu)滴加(jia)入pH7.2飽和硫酸銨溶液(ye)4 ml，邊(bian)加(jia)邊(bian)搖，然(ran)后(hou)再2000 r/min離心10 min，將上清液(ye)倒(dao)入試管中(zhong)，留供后(hou)面實驗用。

2.透(tou)析  去玻璃紙（15cm*15cm）一張，折成袋形，將前面*次鹽析得到的含清蛋白的上清液倒入袋內，用線繩扎緊上口（注意要留有空隙），使透析袋下半部浸入盛有半杯蒸餾水中，對蛋白液進行透析，并用玻璃棒攪拌袋外液體，以縮短透析時間。還應經常換水，并用納氏試劑檢查袋外液體的NH₄⁺，觀察顏色變化，直至袋內NH₄⁺透析完畢。將袋內液體倒入試管，既得牛血清清蛋白溶液。

3.電泳 

①.點樣(yang) 取一(yi)條(tiao)2.5cm*8cm膜(mo)條(tiao)，將(jiang)無(wu)光(guang)澤面(mian)向下，放(fang)入培養皿中的(de)(de)(de)(de)巴比妥緩沖(chong)液(ye)中使(shi)膜(mo)條(tiao)充分浸(jin)透，取出，用(yong)干凈濾紙吸去多余的(de)(de)(de)(de)緩沖(chong)液(ye)，以醋纖膜(mo)的(de)(de)(de)(de)無(wu)光(guang)澤面(mian)距(ju)一(yi)端1.5 cm處作為(wei)點樣(yang)線(xian)，將(jiang)牛血清樣(yang)品與待測(ce)的(de)(de)(de)(de)牛血清清蛋(dan)白溶液(ye)分別用(yong)點樣(yang)器在同一(yi)張薄膜(mo)的(de)(de)(de)(de)點樣(yang)線(xian)處不(bu)同位置(zhi)點樣(yang)。

②.電(dian)泳 將(jiang)點樣(yang)后的膜條(tiao)置于(yu)電(dian)泳槽(cao)架上，放置時無光澤(ze)面（即點樣(yang)面）向下，點樣(yang)端置于(yu)陰極，待平衡5 min后，即可通(tong)電(dian)。用160伏電(dian)壓通(tong)電(dian)60分鐘，通(tong)電(dian)完畢后，用鑷(nie)子(zi)將(jiang)膜條(tiao)取出(chu)。

③.染(ran)(ran)色(se)  將膜條直接浸于(yu)盛(sheng)有氨基黑10B的染(ran)(ran)液(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)，染(ran)(ran)2 min取出，立即浸于(yu)漂(piao)(piao)(piao)洗液(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)，分別(bie)在漂(piao)(piao)(piao)洗液(ye)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中(zhong)(zhong)(zhong)各漂(piao)(piao)(piao)洗5 min，直至背景漂(piao)(piao)(piao)凈為止，用濾紙(zhi)吸(xi)干薄膜。

4.鑒定  比較(jiao)樣品與待測液(ye)中(zhong)清(qing)蛋白在薄膜上的電泳結果，比較(jiao)位置(zhi)是(shi)否一致。

預期結果：如果醋纖膜(mo)上的色帶位(wei)置(zhi)一致，則說明(ming)提取的清蛋白(bai)得到了(le)純化；若在待(dai)測液的電泳結果中出現其他球蛋白(bai)的色帶區(qu)域，則說明(ming)清蛋白(bai)的提取不(bu)夠純。

實驗(yan)儀器(qi)：

實驗(yan)試劑(ji)：

附表：

    PBS試劑：用0.01 mol/L 磷酸鹽(yan)緩沖液(ye)（pH7.2）配制的0.9% NaCl 溶液(ye)。

    pH7.2飽和硫酸銨：用濃氨(an)水將(jiang)飽和硫酸銨溶(rong)液調(diao)到pH7.2。

    漂洗液：95%乙醇45 ml，冰醋(cu)酸5 ml，蒸(zheng)餾水(shui)50 ml。

    氨基黑10B 染色液：氨基黑10B 0.5g,甲(jia)醇50 ml,冰醋酸(suan)10 ml,蒸(zheng)餾水(shui)40 ml。

巴比妥緩沖液：巴比妥(tuo)鈉12.76g,巴比妥(tuo)1.66g，用少量蒸餾水(shui)加(jia)熱溶(rong)解后(hou)，再加(jia)水(shui)稀釋至1000 ml。

納氏(shi)試劑(ji)：溶(rong)(rong)(rong)解碘(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)化鉀(jia)(jia)30g于(yu)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)(shui)20ml內，再(zai)加入(ru)碘(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)22.5g振搖使其溶(rong)(rong)(rong)解。于(yu)此碘(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)液(ye)(ye)(ye)內加入(ru)純汞30g，用(yong)力(li)搖振之，待溫度(du)升高時，將(jiang)燒瓶(ping)浸于(yu)冷水(shui)(shui)內，并(bing)繼續(xu)搖勻，直到暗棕碘(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)色(se)轉變(bian)為(wei)(wei)淡黃綠色(se)為(wei)(wei)止(zhi)。將(jiang)上(shang)層(ceng)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)傾出(chu)，置(zhi)于(yu)量(liang)筒(tong)內，并(bing)以蒸(zheng)餾(liu)水(shui)(shui)少許洗(xi)滌(di)(di)燒瓶(ping)，將(jiang)洗(xi)滌(di)(di)液(ye)(ye)(ye)一并(bing)傾入(ru)。吸(xi)取此配成之溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)1到2滴，加入(ru)1%可溶(rong)(rong)(rong)性(xing)淀(dian)粉(fen)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)1 ml內，以試驗有無(wu)(wu)多余的碘(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)存在，如(ru)不顯藍色(se)（即無(wu)(wu)多余碘(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)存在），可加入(ru)碘(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)液(ye)(ye)(ye)（碘(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)化鉀(jia)(jia)3g，碘(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)2.5g溶(rong)(rong)(rong)于(yu)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)(shui)10 ml內配成）數(shu)滴于(yu)配成之溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)內，直至此液(ye)(ye)(ye)加于(yu)淀(dian)粉(fen)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)內初顯藍色(se)為(wei)(wei)止(zhi)；將(jiang)此液(ye)(ye)(ye)以蒸(zheng)餾(liu)水(shui)(shui)稀釋至200 ml，加10%氫氧化鈉溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)975 ml，混合，即成納氏(shi)試劑(ji)(ji)。試劑(ji)(ji)新配成呈現混濁，靜(jing)置(zhi)數(shu)日，待其沉淀(dian)，再(zai)吸(xi)上(shang)清液(ye)(ye)(ye)供用(yong)。