抗體芯(xin)片技術

蛋白質是一(yi)切生命活動的(de)基(ji)礎，受基(ji)因表達(da)的(de)調控，因而以檢測樣(yang)品中的(de)mRNA為基礎的(de)cDNA芯片(pian)是(shi)當(dang)今研究(jiu)(jiu)中(zhong)倍(bei)受(shou)關注的研究(jiu)(jiu)手段。但(dan)是(shi)，由于(yu)存在著轉錄(lu)后加(jia)工(gong)、翻(fan)譯調控以及翻(fan)譯后加(jia)工(gong)等多種調節(jie)機(ji)制(zhi)，基因的表達，或者(zhe)說(shuo)mRNA的(de)水平并不必(bi)然(ran)代表蛋白(bai)質產物(wu)的(de)水平。因此，以微(wei)陣列技術(shu)對生(sheng)物(wu)樣品作整體蛋白(bai)質表達分析的(de)蛋白(bai)芯(xin)片在后基因組時(shi)代越來越受重視(shi)。抗體芯(xin)片（Antibody Microarray，抗體微陣列），是蛋(dan)白(bai)質(zhi)芯片的一種，是檢測生物(wu)(wu)樣品(pin)中(zhong)蛋(dan)白(bai)表(biao)達(da)模式的新方(fang)法。這(zhe)種新技(ji)術使得研究人員可以在一次(ci)實驗中(zhong)比較生物(wu)(wu)樣品(pin)中(zhong)成百(bai)上千的蛋(dan)白(bai)質(zhi)的相對豐度，將極大(da)促(cu)進蛋(dan)白(bai)質(zhi)組目前的研究狀況——因為以(yi)現有的(de)技術中對蛋白質進行(xing)這種復雜的(de)分析是非常困難的(de)。

      Clontech公司(si)*代的抗體芯片(pian)Ab Microarray 380（Cat.No.K1847-1）包含固定在玻璃片基上的378種已(yi)知蛋白質的(de)單克隆抗體，可以在一次簡(jian)單實驗中(zhong)同(tong)時檢測(ce)樣(yang)品中(zhong)的(de)378種蛋(dan)白質的表(biao)(biao)達情況，并且可以在一張芯(xin)片上(shang)對兩(liang)種樣品(pin)的表(biao)(biao)達模式進行比較分析。這使得抗體芯(xin)片在毒(du)性實驗、疾病研究(jiu)和藥物開發上(shang)有(you)廣泛(fan)的應(ying)用前景。Ab Microarray 380芯片(pian)上每個抗(kang)體都是并列(lie)雙點以增加結果的(de)(de)可(ke)靠性，抗(kang)體針對(dui)廣(guang)泛的(de)(de)胞內蛋(dan)白和膜結合蛋(dan)白，已(yi)知參與信號傳導(dao)、癌癥、細胞周期調控、細胞結構、凋亡和神經(jing)生(sheng)物(wu)學等廣(guang)泛的(de)(de)生(sheng)物(wu)功能，因而(er)可(ke)以用于檢測某一特(te)定的(de)(de)生(sheng)理(li)(li)或病(bing)理(li)(li)過(guo)程相關蛋(dan)白的(de)(de)表達模式。盡(jin)管抗(kang)原來自人，但很多抗(kang)體可(ke)以識別小鼠或大(da)鼠的(de)(de)樣品(pin)。詳細的(de)(de)資料可(ke)以上網查(cha)詢。

      芯片上抗體(ti)(ti)(ti)(ti)的選擇(ze)不但根(gen)據(ju)其特(te)異(yi)性(xing)(xing)，也根(gen)據(ju)抗體(ti)(ti)(ti)(ti)的結(jie)合親和力，在驗(yan)證實驗(yan)中特(te)異(yi)性(xing)(xing)低、交(jiao)叉反(fan)應高、或者信號強度(du)低的抗體(ti)(ti)(ti)(ti)都(dou)被(bei)排(pai)除(chu)，另外所有抗體(ti)(ti)(ti)(ti)都(dou)經(jing)過(guo)檢驗(yan)保證得(de)到的信號與抗原濃度(du)有良好的線(xian)性(xing)(xing)相關，那些沒有良好的線(xian)性(xing)(xing)劑量關系的抗體(ti)(ti)(ti)(ti)都(dou)被(bei)排(pai)除(chu)。因此抗體(ti)(ti)(ti)(ti)芯片能夠(gou)檢測到樣品中很低的pg/ml濃度的抗原。

      *代的蛋白芯片和DNA芯片一樣是(shi)作為一種定性分析的(de)工具，可用于分析樣品之間相關(guan)蛋白的(de)相對(dui)表(biao)達豐度；還可以(yi)作為DNA芯(xin)片的補充(chong)，用于研究蛋白和基(ji)因表達(da)之(zhi)間的關(guan)系。

操作流程(cheng)
      抗(kang)體(ti)芯(xin)片(pian)并不(bu)要求特(te)殊的技能，只要一般(ban)常(chang)規的操(cao)作(zuo)(zuo)就可(ke)以完成以往極為(wei)復雜耗時的工(gong)作(zuo)(zuo)。整個操(cao)作(zuo)(zuo)流程包括：從50—200mg組織或(huo)細胞、體液中進行蛋白質抽提——用Cy5和Cy3兩種不同(tong)顏色的熒光分子分別(bie)標記兩個樣品——洗去多余(yu)的標記分子——與芯片雜交孵育——掃描(miao)分(fen)析結(jie)(jie)果。整(zheng)個(ge)過程從樣品(pin)制(zhi)備(bei)到結(jie)(jie)果分(fen)析只要一(yi)天即可完成，你只要準(zhun)備(bei)好樣品(pin)、熒(ying)光(guang)染料、脫(tuo)鹽純化(hua)柱（處理(li)體(ti)液樣品(pin)時用）和(he)熒(ying)光(guang)掃描(miao)儀，其他的試劑全部由試劑盒提供。

優化的(de)試劑
      隨芯片試(shi)劑盒提(ti)供的蛋白抽提(ti)/標記緩沖液，是專門(men)為(wei)抗體芯片而(er)設計的，非常溫和的去(qu)垢劑在能抽提(ti)膜(mo)結合蛋(dan)白（相比(bi)SDS煮沸法能(neng)抽提(ti)95%以上的(de)(de)蛋(dan)白(bai)）的(de)(de)同時能保持蛋(dan)白(bai)的(de)(de)天(tian)然(ran)活性(xing)(xing)（非變性(xing)(xing)條件），這(zhe)樣能夠保證抽提的(de)(de)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)溶解性(xing)(xing)和(he)(he)代表性(xing)(xing)，保證以后的(de)(de)實驗結果的(de)(de)真實性(xing)(xing)，和(he)(he)原始(shi)材料的(de)(de)一致性(xing)(xing)。

Internally Normalized Ratio
      根據(ju)操作手冊進行內(nei)源標(biao)準化處理可以(yi)得到一個內(nei)源標(biao)準化信噪比（INR），內源標準化(hua)處理是指對兩個樣品（A、B）中分別用兩種(zhong)熒光標記分子(zi)（Cy3和Cy5）標記，并交(jiao)叉與芯(xin)片雜交(jiao)（見圖(tu)，A-Cy5和B-Cy3一組,A-Cy3和B-Cy5一組分(fen)別(bie)和芯片雜交），可以(yi)作為消(xiao)除抗原—抗體結合效(xiao)率差異的對照，也(ye)可以(yi)消除(chu)潛在的不(bu)同熒光分(fen)子的標記效(xiao)率差異。假(jia)如Cy5標(biao)記效率高于Cy3，單純一個實驗的結果就會有(you)偏(pian)差（Cy5標記的樣品(pin)信號偏高），用這種雙(shuang)向(xiang)交叉反應(ying)就(jiu)可以消除這種偏差。兩(liang)芯(xin)片雜交結果分別(bie)得到兩(liang)組Ratio值，通過(guo)免費下(xia)載的工(gong)具就可以自動算(suan)出每個(ge)抗體抗原的INR值，這就代表在(zai)兩個樣品間某個蛋(dan)白的相對豐(feng)度。這種內源標準化(hua)處(chu)理可以(yi)大大減小樣品分析(xi)的偏差。

      抗體芯片(pian)檢測的(de)結果不是(shi)蛋白的(de)含量而是(shi)378個(ge)目的(de)蛋白(bai)在(zai)兩(liang)個(ge)樣品之間的(de)相對豐(feng)度。值得注意的(de)是由于(yu)抗體抗原結(jie)合的(de)差異、標記差異等原因(yin)，根據芯(xin)片(pian)結(jie)果信(xin)號的(de)強弱(ruo)判斷同一(yi)樣品中兩(liang)種不(bu)(bu)同蛋白(bai)的(de)多少是不(bu)(bu)恰當的(de)。

特點
* 整個分析過(guo)程可以在(zai)一(yi)天(tian)內完成
* 用熒光分(fen)析的方法比(bi)較(jiao)兩個樣品之間378個蛋白(bai)質的相對豐度(du)
* 適用于包括組織(zhi)、細(xi)胞系、體(ti)液在內(nei)的多種生(sheng)物樣品
* 試劑(ji)盒提供(gong)完整(zheng)的樣品(pin)抽提制備、標(biao)記、孵育所(suo)需的Buffer，特別設計的樣品(pin)制備(bei)的過程(cheng)能(neng)保(bao)持樣品(pin)的完(wan)整性(xing)和(he)溶解性(xing)，保(bao)證制備(bei)樣品(pin)具有(you)代表性(xing)和(he)一(yi)致性(xing)。
* 芯(xin)片上的抗體包含針對信號(hao)傳(chuan)導、癌癥、細(xi)胞(bao)周期調控、細(xi)胞(bao)結構、凋亡和神經(jing)生(sheng)物學等廣(guang)泛的生(sheng)物功能的相關蛋白，跨度(du)大、適用范圍廣(guang)。
* 芯片(pian)上(shang)的抗體分別經過特異(yi)性(xing)抗原、細胞系和組織的檢測，靈敏度高達pg/ml
* 開放性的芯片平臺(tai)設計(ji)，可以用(yong)各種型號DNA芯片熒光掃描儀進(jin)行檢測。