ELISA常見問題(ti)

ELISA方法(fa)被廣泛應用于各(ge)種(zhong)抗(kang)原和抗(kang)體測定。但ELISA測定中影(ying)響因素較多，而且(qie)其操作中有(you)一(yi)定的技術要(yao)求，在(zai)檢測過程(cheng)中除正常(chang)反應外(wai)，有(you)時常(chang)見到一(yi)些錯誤的結果。引起(qi)ELISA測定錯(cuo)誤結果(guo)的原(yuan)因主要(yao)有：①標本(ben)因素(su)；②試劑因素；③操作因素。下面就一些常見ELISA操作過程中的問題一一分析。
1．樣品稀釋
酶(mei)聯免疫反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)是一種敏感性很高的(de)反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)，如果(guo)血(xue)清(qing)不稀釋(shi)，不可(ke)避免會(hui)產(chan)生很強的(de)非特(te)異性反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)，出(chu)現(xian)假陽性。因此，國外檢(jian)測血(xue)清(qing)抗(kang)(kang)體的(de)試劑盒(he)，均規定將(jiang)血(xue)清(qing)稀釋(shi)至適(shi)當(dang)的(de)倍(bei)數(shu)，以(yi)降低非特(te)異性反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)，使特(te)異性的(de)抗(kang)(kang)原(yuan)抗(kang)(kang)體反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)充分(fen)體現(xian)出(chu)來(lai)。一般產(chan)品(pin)的(de)樣品(pin)稀釋(shi)倍(bei)數(shu)均通過大量試驗確定，以(yi)保證試驗的(de)靈敏度和(he)特(te)異性。但是，有些用戶未(wei)能嚴格按使用說明(ming)書操作，如某些產(chan)品(pin)應(ying)(ying)(ying)取10μl樣品進行稀釋，個別用戶(hu)取(qu)5μl甚至1μl樣品進行稀(xi)釋，由于吸嘴(zui)上不(bu)(bu)可避免(mian)地沾有樣品以及微量移(yi)液器的精度不(bu)(bu)夠，因(yin)此造成樣品稀(xi)釋倍(bei)數不(bu)(bu)準確，檢測結果出(chu)現(xian)問題。
2．試劑盒平(ping)衡
試劑盒中所有試劑和(he)板(ban)條(tiao)均應在試驗前平衡至室溫(約25℃)，一般需在室溫放(fang)置20～30分(fen)鐘以上。平衡時間(jian)太短會造成試劑混勻不夠，樣(yang)品孵(fu)育時間(jian)相對(dui)縮短，ELISA反應不夠充分。冬季(ji)室溫低，可將試劑盒(he)置37℃溫(wen)箱20分(fen)鐘(zhong)。
3．樣品和試劑的混勻
稀釋前(qian)、后(hou)的樣品必須充分混勻(yun)，所有試劑在加樣前(qian)也須搖勻(yun)，以保證試驗的均一(yi)性(xing)。
4．加樣
在現(xian)在的ELISA商品試(shi)劑盒中，必然有(you)使用(yong)微量加(jia)樣器加(jia)入(ru)樣本的(de)步驟(zou)。注意的(de)關鍵點是(shi)(shi)：加(jia)樣不可太快，要避免加(jia)在(zai)孔壁上(shang)部，不可濺出和產生(sheng)氣泡。加(jia)樣太快，無(wu)法保證微量加(jia)樣的(de)準確(que)性和均一(yi)性。加(jia)在(zai)孔壁上(shang)部的(de)非包被區(qu)，易(yi)導致(zhi)非特異(yi)吸附。濺出會對(dui)鄰(lin)近孔產生(sheng)污染。出現氣泡則(ze)反應液界面有(you)差異(yi)。所以，有(you)時(shi)候一(yi)份(fen)標本用(yong)相同的(de)試(shi)劑盒這(zhe)次測定為陽(yang)性，下次測定為陰性，往往就是(shi)(shi)上(shang)述(shu)加(jia)樣及試(shi)劑的(de)錯(cuo)誤所致(zhi)。
5．溫育
溫(wen)育(yu)是ELISA測定中影響測定成敗zui為關鍵的(de)一個因素。ELISA作為一種固相免疫測(ce)定(ding)，抗(kang)(kang)(kang)(kang)原抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)的(de)結(jie)合反(fan)(fan)應在固相上(shang)進行(xing)，要使(shi)液相中的(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原或(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)與(yu)固相上(shang)的(de)特異抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)或(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原*結(jie)合，必須在一定(ding)的(de)溫(wen)(wen)度(du)條件下反(fan)(fan)應一定(ding)的(de)時間。溫(wen)(wen)育所需時間與(yu)溫(wen)(wen)度(du)成(cheng)反(fan)(fan)比，即(ji)溫(wen)(wen)度(du)越高，則所需時間相對(dui)較短。zui為常用的(de)溫(wen)(wen)育溫(wen)(wen)度(du)有37℃和(he)室溫，其次是43℃和(he)2～8℃。一(yi)些操作者(zhe)，擅自改變說明書操作，使用自己(ji)喜(xi)歡的(de)溫育(yu)(yu)時(shi)(shi)間(jian)和(he)溫育(yu)(yu)溫度，這樣造成一(yi)些不(bu)必要的(de)麻(ma)煩。因為，不(bu)同試(shi)(shi)劑盒有不(bu)同的(de)溫育(yu)(yu)時(shi)(shi)間(jian)和(he)溫育(yu)(yu)溫度的(de)選(xuan)擇，隨意更改溫育(yu)(yu)時(shi)(shi)間(jian)或(huo)者(zhe)溫育(yu)(yu)溫度將導(dao)致試(shi)(shi)驗結果(guo)出現偏差。
6．洗板
固相免(mian)疫(yi)測(ce)定(ding)技術是一種非均相免(mian)疫(yi)測(ce)定(ding)技術，需以洗滌操作(zuo)將特(te)(te)異結合(he)于(yu)固相的(de)抗(kang)原(yuan)或抗(kang)體與反應溫育過程中吸附的(de)非特(te)(te)異成份分(fen)離開來(lai)，以保證ELISA測定的特異性(xing)。洗板對于ELISA測定來說，也是極(ji)其關(guan)鍵的一步。洗液盡量不要溢出孔(kong)外；加洗液后要靜置(zhi)1分鐘(zhong)，甩去(qu)板孔中洗液后，一(yi)定(ding)要(yao)大力拍干；及時更換(huan)吸水紙(zhi)，尤其是拍過酶標記物的吸水紙(zhi)一(yi)定(ding)要(yao)棄去(qu)，否(fou)則(ze)可能(neng)影響試驗結(jie)果。
7．邊緣效應
使(shi)用96孔板的ELISA測定中，常(chang)發現有(you)“邊緣效(xiao)應”，即外周孔顯色較中心(xin)孔深。經研究證實在溫育中的(de)熱力學梯(ti)度可能是根(gen)本(ben)(ben)原因(yin)之所。聚苯乙烯(xi)本(ben)(ben)身為(wei)不良(liang)熱導體，在實驗(yan)室的(de)常(chang)規ELISA測定中，將板從(cong)室溫（通常在(zai)25℃左右）置于37℃溫(wen)(wen)箱(xiang)，板也升溫(wen)(wen)時，在(zai)外(wai)周孔(kong)與中(zhong)心孔(kong)之間可能存(cun)在(zai)一熱(re)力學(xue)梯度(du)。因此(ci)使用水浴或在(zai)將反應(ying)溶(rong)液加(jia)(jia)入(ru)至板孔(kong)中(zhong)時，將板和溶(rong)液均加(jia)(jia)熱(re)至溫(wen)(wen)育溫(wen)(wen)度(du)（如37℃），就(jiu)可(ke)以很容易地(di)排除“邊緣效應(ying)”，并(bing)且可提高測定的重復(fu)性。
8．顯色
顯(xian)色一定要控制時間,根據(ju)試劑盒說明(ming)操(cao)作即可。一般來(lai)說，顯色時間過(guo)短，結果(guo)偏低；顯色時間過(guo)長，空白(bai)增(zeng)高(gao)或者非特異性顯色增(zeng)加。
9．比色
比色(se)要注意波長的選擇。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有(you)使(shi)用，而前者(zhe)比色波長為450nm，后(hou)者為492nm，濾光(guang)片(pian)(pian)需根據要求隨時更(geng)換。因(yin)此，容易出現濾光(guang)片(pian)(pian)錯用(yong)的問題(ti)。
其次，單波(bo)長(chang)或雙波(bo)長(chang)比色(se)(se)選擇的問題。所謂的單波(bo)長(chang)比色(se)(se)即是通常的以對顯色(se)(se)具有zui大(da)吸收的波(bo)長(chang)如450nm或492nm進行比色測定；而雙(shuang)波(bo)長雙(shuang)色則酶標儀(yi)在(zai)敏感波(bo)長如450nm和非敏感波長如630nm下各測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)一(yi)次，敏感(gan)波(bo)上下的(de)(de)(de)(de)吸光(guang)(guang)(guang)度測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)值(zhi)為(wei)樣(yang)(yang)本測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)酶反應特(te)異(yi)顯(xian)色(se)的(de)(de)(de)(de)吸光(guang)(guang)(guang)度與板孔(kong)(kong)上指紋、刮痕、灰塵(chen)(chen)等臟(zang)物所(suo)致的(de)(de)(de)(de)吸光(guang)(guang)(guang)度之(zhi)和；非(fei)敏感(gan)波(bo)長(chang)(chang)下測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)即改變(bian)波(bo)長(chang)(chang)至一(yi)定(ding)(ding)(ding)值(zhi)，使得樣(yang)(yang)本測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)酶反應特(te)異(yi)顯(xian)色(se)的(de)(de)(de)(de)吸光(guang)(guang)(guang)度值(zhi)為(wei)零，此時測(ce)(ce)得的(de)(de)(de)(de)吸光(guang)(guang)(guang)度即為(wei)臟(zang)物的(de)(de)(de)(de)吸光(guang)(guang)(guang)度值(zhi)。zui后酶標(biao)(biao)儀給出的(de)(de)(de)(de)數(shu)值(zhi)為(wei)敏感(gan)波(bo)長(chang)(chang)下的(de)(de)(de)(de)吸光(guang)(guang)(guang)度值(zhi)與非(fei)常感(gan)波(bo)長(chang)(chang)下的(de)(de)(de)(de)吸光(guang)(guang)(guang)度值(zhi)的(de)(de)(de)(de)差。因此，雙波(bo)長(chang)(chang)比色(se)測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)具有能(neng)排除由微(wei)滴板本身、板孔(kong)(kong)內標(biao)(biao)本的(de)(de)(de)(de)非(fei)特(te)異(yi)吸收(shou)、指紋、刮痕、灰塵(chen)(chen)等對特(te)異(yi)顯(xian)色(se)測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)吸光(guang)(guang)(guang)度的(de)(de)(de)(de)影響的(de)(de)(de)(de)優點(dian)。由于ELISA測定(ding)(ding)(ding)中單個(ge)空(kong)白(bai)(bai)孔(kong)的(de)非特異吸收上(shang)有一定(ding)(ding)(ding)程度的(de)不確定(ding)(ding)(ding)性，也就(jiu)是(shi)說每(mei)次測定(ding)(ding)(ding)或同(tong)次測定(ding)(ding)(ding)空(kong)白(bai)(bai)孔(kong)位置(zhi)的(de)不同(tong)均有可能得到不同(tong)吸光度測定(ding)(ding)(ding)值(zhi)，故而(er)在ELISA測定比(bi)色(se)時，是使(shi)用雙波長比(bi)色(se)。

綜上所述(shu)，盡管ELISA測(ce)(ce)定(ding)(ding)的操作步驟非(fei)常(chang)(chang)簡單(dan)，但有(you)可(ke)能(neng)會影響測(ce)(ce)定(ding)(ding)結果的因素卻較多，分布在測(ce)(ce)定(ding)(ding)操作的各步之中，尤以(yi)加樣、溫育和洗(xi)板為(wei)(wei)甚。為(wei)(wei)幫助(zhu)大(da)家分析查(cha)找(zhao)測(ce)(ce)定(ding)(ding)中出現問題的可(ke)能(neng)原因，特對(dui)常(chang)(chang)見問題及原因歸納總結于下表(biao)。

操作(zuo)過程中可能出現的問題和(he)解決方法