如何選擇抗體

1.定制單抗還是多抗？
首先應(ying)該(gai)考慮的(de)就是定(ding)制的(de)抗體是應(ying)用于什么實(shi)驗，需要的(de)量(liang)是多(duo)少(shao)？

對(dui)于(yu)科研用戶來說
1. 抗(kang)體常常應用于WesternBlotting、IP等(deng)實驗中，對于抗體的特(te)異性有(you)一定的要求(qiu)，但并不是特(te)別(bie)的強調
2. 往往在(zai)研究(jiu)很(hen)多(duo)新的(de)蛋白(bai)時(shi)，并不確定新蛋白(bai)是(shi)(shi)否很(hen)重要(yao)，是(shi)(shi)否會是(shi)(shi)將(jiang)來很(hen)長(chang)一(yi)段(duan)時(shi)間的(de)研究(jiu)重點，所(suo)(suo)以(yi)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體用量也(ye)不大所(suo)(suo)以(yi)針(zhen)對(dui)科(ke)研用戶，在(zai)定制(zhi)新的(de)蛋白(bai)的(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體時(shi)，我們(men)強烈建議首先制(zhi)備多(duo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)用于實(shi)驗(yan)，當得(de)到了理想的(de)實(shi)驗(yan)結果并需要(yao)長(chang)期的(de)使(shi)用該抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體時(shi)再考慮制(zhi)備單抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)。當然，如果您對(dui)該抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體的(de)特異性(xing)要(yao)求(qiu)特別高（多(duo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)的(de)特異性(xing)已無法滿足實(shi)驗(yan)要(yao)求(qiu)，比如應用于流式細胞術等）時(shi)，還是(shi)(shi)應該定制(zhi)單抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)

對(dui)于工業用戶來說
1. 抗體往往應用于檢測定量實驗或者功(gong)能性實驗，對(dui)于抗體的(de)特異性要求非常(chang)之高
2. 目標蛋白基本上(shang)都是已知的確定有相(xiang)當商(shang)業開發價值的，而(er)且產品(pin)一旦形成，用量會非常大所以針對工業用戶(hu)，基本上(shang)可以直接定制(zhi)單抗

2.該選多肽還是蛋白作(zuo)為抗原呢(ni)？

需要(yao)根(gen)據(ju)抗體(ti)應用于什么(me)實驗，以及(ji)您所能獲得的(de)材料來決定
 
 1. 實驗(yan)過程中蛋白(bai)處(chu)于天然狀態，這時使用的(de)(de)抗(kang)體識別的(de)(de)一般是蛋白(bai)的(de)(de)構象(xiang)表位(wei)和(he)線性(xing)表位(wei)；這樣的(de)(de)實驗(yan)主要有CO-IP、FACS、Neutralizing/Blocking以(yi)及Elisa法檢測天然蛋白等(deng)
2. 實驗(yan)過(guo)程中(zhong)蛋白(bai)處于變性或半變性狀態，這時大(da)部(bu)分的構(gou)象表(biao)(biao)位(wei)已被破壞，抗體識別的一(yi)般(ban)都是線性表(biao)(biao)位(wei)；這樣的實驗(yan)主(zhu)要(yao)有：Western、IHC/ICC/IF等以(yi)(yi)多肽(tai)作(zuo)為(wei)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原制(zhi)備(bei)的抗(kang)(kang)(kang)(kang)體，識別(bie)的是線性(xing)表位，在(zai)使用(yong)時蛋白處(chu)于變(bian)性(xing)或(huo)半變(bian)性(xing)狀態下(xia)，結果可以(yi)(yi)令人滿意(yi)；但不能夠保(bao)證識別(bie)天然(ran)蛋白以(yi)(yi)蛋白作(zuo)為(wei)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原制(zhi)備(bei)的抗(kang)(kang)(kang)(kang)體，識別(bie)蛋白的線性(xing)和構象表位，基本上所有的實驗都可以(yi)(yi)應用(yong)，所以(yi)(yi)，用(yong)蛋白作(zuo)為(wei)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原應是，但是在(zai)多肽(tai)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原已可滿足實驗要求而(er)且得到(dao)蛋白有一定難(nan)度的情況下(xia)，以(yi)(yi)多肽(tai)作(zuo)為(wei)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原制(zhi)備(bei)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體更(geng)加合適。

3、什么情(qing)況應該(gai)考慮用設計(ji)多肽(tai)做抗原？

答：如(ru)果氨基酸序列已知，但是由(you)于(yu)基因克隆(long)或(huo)(huo)表(biao)達等原(yuan)因得(de)(de)不到抗原(yuan)蛋(dan)(dan)白，或(huo)(huo)者僅需要得(de)(de)到針對抗原(yuan)蛋(dan)(dan)白某幾個特(te)定表(biao)位的抗體(ti)，就可(ke)以采用多肽(tai)合成的方式得(de)(de)到抗原(yuan)。例如(ru)僅需要生(sheng)產針對蛋(dan)(dan)白質(zhi)某個區域的特(te)異抗體(ti)，比(bi)如(ru)研究蛋(dan)(dan)白質(zhi)N端的前(qian)體物，可以設(she)計N末端的(de)多(duo)肽(tai)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)。如果抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)的(de)使(shi)用(yong)目的(de)是識(shi)別修飾(shi)的(de)氨(an)(an)基酸(suan)，如磷酸(suan)化的(de)絲氨(an)(an)酸(suan)、蘇(su)氨(an)(an)酸(suan)或(huo)者酪氨(an)(an)酸(suan)，乙酰(xian)化賴氨(an)(an)酸(suan)等，就必須(xu)對多(duo)肽(tai)進行相應的(de)修飾(shi)。一般情(qing)況(kuang)下抗(kang)(kang)(kang)血清能夠(gou)識(shi)別用(yong)來免疫(yi)的(de)多(duo)肽(tai)序列，但是不一定識(shi)別天(tian)然蛋白(bai)質(zhi)的(de)折疊(die)結(jie)構(gou)。非連續性抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)的(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)能否識(shi)別抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)決定簇取(qu)決于(yu)用(yong)于(yu)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)生(sheng)產的(de)多(duo)肽(tai)是否存(cun)在二級結(jie)構(gou)。

4、設計多肽做抗原時的幾(ji)點基本原則？

答(da)：識別(bie)區域的選(xuan)擇原(yuan)(yuan)則一般說來(lai)的抗(kang)原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)識別(bie)區域應具備(bei)親水、位于蛋白表面和結構上易變形性(xing)(xing)等特點。既要考慮(lv)其免(mian)疫原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)、特異(yi)性(xing)(xing)，還需考慮(lv)其合成難度等。通常有以下幾點建議(yi)：1、序列長度在8-20個(ge)氨基(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)之間（如果太短(duan)，就有多肽(tai)太特殊(shu)、所產生的抗體與天(tian)然蛋白之間的親和(he)力（結合能力）不夠強(qiang)的風險，同樣，如果序列長度超過(guo)20，將(jiang)有可能(neng)引入二級結構，所(suo)產(chan)生(sheng)的抗(kang)體(ti)失去特異(yi)性的可能(neng)，而且肽鏈越長(chang)，通常合成難度增大，不易獲得高純(chun)度的產(chan)品）；2、盡可能是在蛋白表面；3、保(bao)證該段序列不形成α-helix；4、N，C端的肽段比(bi)中間(jian)的肽段更好(hao)；避免(mian)蛋白內部重(zhong)(zhong)復或接近重(zhong)(zhong)復段的序列；5、避免(mian)同(tong)源性(xing)太(tai)強的肽段；6、交聯(lian)可以交聯(lian)在(zai)N，C兩端，選擇(ze)依據就(jiu)是交聯在對產生抗體(ti)不(bu)太重要的一端；7、序列(lie)中(zhong)不能有太多(duo)的Pro，但有(you)一(yi)兩個(ge)Pro有好處，可(ke)以使肽鏈(lian)結構相對(dui)(dui)穩定一(yi)些，對(dui)(dui)產生特異性抗體(ti)有益。

5、原核表達含GST標簽(qian)的蛋白制備抗體時，需要切(qie)掉(diao)GST標(biao)簽嗎？

答(da)：如果目的(de)蛋(dan)白很大且(qie)之后的(de)實驗不受GST影(ying)響的(de)話，GST標簽是不用切掉的。但是如(ru)果目(mu)的蛋(dan)白小于20KD的話(hua)，建議通(tong)過實驗(yan)切除(chu)GST標簽。

6、抗體(ti)的保存：

答：小(xiao)包(bao)分批，避(bi)免多次反復凍融。短期：4度冰(bing)箱保存。長期：-20度，一般需要(yao)加入甘油，BSA等(deng)。

7、關于抗(kang)原的常識

對抗(kang)(kang)原(yuan)的要求是純度(du)越高越好，尤其(qi)是初次免(mian)疫所用的抗(kang)(kang)原(yuan)。如為細胞(bao)抗(kang)(kang)原(yuan)，可取1×107個細胞作腹腔免(mian)(mian)疫。可溶性(xing)抗(kang)原(yuan)需加*福氏佐劑并經充分乳化，如為聚丙烯(xi)酰胺電(dian)泳純(chun)化的抗(kang)原(yuan)，可將抗(kang)原(yuan)所在(zai)的電(dian)泳條帶切下，研磨后直接用以動物免(mian)(mian)疫。還有一些(xie)半抗(kang)原(yuan)，如多肽，在(zai)免(mian)(mian)疫之前是需要耦聯一些(xie)蛋白，如KLH，BSA等(deng)。病毒類的(de)抗原(yuan)，可(ke)以(yi)直接(jie)用于免疫。如果是(shi)蛋(dan)白(bai)，一(yi)般來說，蛋(dan)白(bai)的(de)純度(du)要在90％以(yi)上，濃度在1mg/ml以上，分子(zi)量(liang)>10kd。一般融解(jie)在無毒的(de)緩沖液中，建議溶(rong)解(jie)在PBS中

1. 根據實(shi)驗

ELISA、熒光免(mian)(mian)疫組(zu)化的抗(kang)原可(ke)能是(shi)線性表位，也可(ke)能是(shi)構(gou)象表位；而石蠟(la)切片酶免(mian)(mian)疫組(zu)化、WB實驗過程中涉及蛋白變性，因此(ci)只能用識別(bie)線性表位的抗(kang)體(ti)，如果(guo)用ELISA、熒光免(mian)(mian)疫組(zu)化抗(kang)體(ti)不一定有反應。

2. 根據(ju)你的(de)標本(ben)的(de)物種來源  

如來源于人(ren)(ren)，抗體(ti)就(jiu)選(xuan)鼠抗人(ren)(ren)、兔抗人(ren)(ren)…

一(yi)抗要與二(er)抗相匹配，如(ru)果(guo)一(yi)抗是(shi)小鼠(shu)來源，那(nei)二(er)抗就買抗小鼠(shu)的(de)；一(yi)抗是(shi)兔(tu)來源，二(er)抗就要抗兔(tu)的(de)。例如(ru)，檢測人組織細胞(bao)因子IL-4，一(yi)抗假如(ru)是(shi)mouse抗人（來源于mouse），二(er)抗就用兔(tu)或(huo)羊或(huo)大鼠(shu)等抗mouse的(de);

3. 抗(kang)整個分子還是(shi)抗(kang)某個亞(ya)基

如(ru)一些(xie)受(shou)體分子由不同(tong)亞基組成，需要用(yong)不同(tong)單(dan)抗；

4. 單克(ke)隆or多(duo)克(ke)隆抗體

單克(ke)隆抗(kang)體特(te)異性強，但親(qin)和力相(xiang)對小，檢測(ce)抗(kang)原靈敏(min)度相(xiang)對低；多克(ke)隆抗(kang)體特(te)異性稍弱，親(qin)和力強，靈敏(min)度高(gao)，但易出現(xian)非特(te)異性染(ran)色.

表達(da)量相(xiang)對較(jiao)高(gao)的(de)抗原(yuan)，盡量選(xuan)擇(ze)單克隆抗體(ti)；不明確(que)表達(da)量情況，且有經濟限制(zhi)和時間限制(zhi)的(de)情況，可以選(xuan)擇(ze)多(duo)克隆抗體(ti)。