人IL-8定(ding)量(liang)分析酶聯免疫檢測試劑盒(he)

IL-8簡介：

    IL-8是(shi)(shi)由巨噬細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)產生的(de)(de)(de)(de)(de)單核因(yin)子，是(shi)(shi)趨化(hua)因(yin)子家族(zu)C-X-C亞(ya)族(zu)（α亞(ya)族(zu)）中的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)員(yuan)，對中性粒細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、T淋巴(ba)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、嗜堿性粒細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)具(ju)有(you)(you)(you)趨化(hua)作(zuo)用(yong)，能夠(gou)吸附中性粒細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，嗜堿性粒細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，但(dan)是(shi)(shi)單核細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)除外。人的(de)(de)(de)(de)(de)IL-8 cDNA 序(xu)列表明有(you)(you)(you)99個(ge)氨基(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)。經(jing)過剪節(jie)(jie)掉22個(ge)個(ge)殘(can)基(ji)后，形成成熟的(de)(de)(de)(de)(de)具(ju)有(you)(you)(you)77個(ge)氨基(ji)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白。IL-8還能夠(gou)調節(jie)(jie)T淋巴(ba)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、B淋巴(ba)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)成熟分化(hua)，在炎癥(zheng)反應、免疫調節(jie)(jie)中起重要作(zuo)用(yong)，并且研究表明IL-8還具(ju)有(you)(you)(you)促進血管(guan)生成的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)。IL-8在人體內(nei)存在兩種(zhong)(zhong)主要形式，一(yi)種(zhong)(zhong)是(shi)(shi)來源于(yu)單核細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)含(han)72個(ge)氨基(ji)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)肽，另一(yi)種(zhong)(zhong)是(shi)(shi)來源于(yu)內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)含(han)77個(ge)氨基(ji)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)肽。72aa比77aa的(de)(de)(de)(de)(de)IL-8具(ju)有(you)(you)(you)更高的(de)(de)(de)(de)(de)趨化(hua)活性，而77aa的(de)(de)(de)(de)(de)IL-8具(ju)有(you)(you)(you)誘(you)導白血病細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)凋(diao)亡的(de)(de)(de)(de)(de)功(gong)能，其位(wei)于(yu)N端的(de)(de)(de)(de)(de)五肽序(xu)列已被(bei)確定是(shi)(shi)IL-8具(ju)有(you)(you)(you)誘(you)導凋(diao)亡功(gong)能的(de)(de)(de)(de)(de)活性部位(wei)。

檢測(ce)原(yuan)理(li):

    本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中IL-8 的濃度。IL-8 捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的IL-8 會與捕獲抗體結合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入生物素化的抗人IL-8 抗體后，抗人IL-8 抗體與IL-8 接合，形成夾心的免疫復合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。zui后加入顯色劑，若樣本中存在IL-8 將會形成免疫復合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，IL-8 濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中IL-8 濃度。

人定(ding)量分(fen)析酶聯免疫檢(jian)測試劑盒(he)組(zu)成:

標本收集(ji):

1.標(biao)本(ben)的(de)收集請按下列流程進行(xing)操作：

A.細胞上清(qing)標(biao)本(ben)離(li)心(xin)去除(chu)懸浮物(wu)后(hou)即(ji)可；

B.血(xue)清標本應是自然凝固后，取上清，避(bi)免在冰箱中凝固血(xue)液；

C.血漿標本(ben)，推薦(jian)用(yong)EDTA的方法(fa)收集；

D. 若(ruo)待(dai)測樣(yang)本(ben)不能(neng)及時檢(jian)測，標本(ben)收集后請分裝(zhuang)，凍存于－20℃，避免反復凍融。

2.血(xue)清標本不(bu)應添加(jia)任(ren)何防腐劑(ji)或抗凝劑(ji)；

3.標(biao)本(ben)應(ying)清澈透(tou)明(ming)，檢測前樣本(ben)中如有懸浮(fu)物應(ying)通過離心去除；

4.請勿(wu)使用溶血(xue)，高血(xue)脂或污染的標本檢測，否則結果將不準確。

注：正常人血清或血漿樣本請用標本緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事(shi)項(xiang):

1.試劑盒請保存(cun)在2～8℃。

2.濃縮(suo)洗滌液因在(zai)低溫下可能有結晶，請水浴加(jia)熱使結晶*溶解后再配(pei)制工作(zuo)液。

3.若標準(zhun)品復溶后(hou)，請在三天(tian)內用(yong)完。

4.底物請勿接觸氧化(hua)劑和金屬(shu)。

5.加樣時(shi)，請及時(shi)更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴(yan)禁混(hun)用不同批(pi)號的試劑盒(he)組(zu)份。

7.充分混(hun)勻對保證反應結果的(de)準性很重要，在加液(ye)后(hou)請輕輕叩擊(ji)邊(bian)緣以保證混(hun)勻。

8.室(shi)溫反應，請(qing)嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關(guan)重要的，洗滌不充分(fen)會使度(du)下(xia)降并導(dao)致結果誤差較大。

10.試驗中標(biao)準品和樣本檢測(ce)時建議作(zuo)雙(shuang)復(fu)孔。

11.加樣(yang)過程中避免(mian)氣泡(pao)的(de)產生。

12.血清和血漿標本的(de)檢(jian)測時，檢(jian)測抗體(ti)的(de)孵育時間應適(shi)當延長。

檢測前準備工(gong)作:

1.試(shi)劑盒自冰(bing)箱中取出(chu)后(hou)應置室溫(wen)平衡20分(fen)鐘；每次檢(jian)測后(hou)剩(sheng)余試(shi)劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水(shui)或去離(li)子水(shui)稀(xi)釋(1份加19份水(shui))。

3. 標準品:加入去(qu)離子水(shui)0.75ml至凍(dong)干標準品瓶中使IL-8終濃度達到2000pg/ml，靜置15分鐘后(hou)輕(qing)輕(qing)混(hun)懸待*溶解，用標準品稀(xi)釋液倍比梯度稀(xi)釋后(hou)依次加入檢測孔中。

洗滌方法:

自動(dong)洗板(ban)機或人工(gong)洗板(ban)：每孔(kong)洗滌液為300ul，注入與吸出(chu)間隔15-30秒。洗板(ban)5次(ci)。zui后一次(ci)洗板(ban)完成后將(jiang)板(ban)倒(dao)扣著在厚(hou)吸水(shui)紙上用力拍干。

實驗過(guo)程需自備的材料：

1.不同規格的加樣槍(qiang)及相應(ying)的槍(qiang)頭；   2.酶標儀；       3．自動(dong)洗(xi)板(ban)機；      4．去離子水(shui)或(huo)雙蒸水(shui)；

操作步驟:

1.通過計算并確(que)定一次(ci)性實驗所需(xu)的板條(tiao)(tiao)數，取出所需(xu)板條(tiao)(tiao)放(fang)(fang)置在框架內，暫時用(yong)不到(dao)板條(tiao)(tiao)請放(fang)(fang)回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建(jian)議設置本底較正孔(kong)，即(ji)空白孔(kong),設置方法為(wei)該孔(kong)只加(jia)TMB顯(xian)色液和中止液。每次實驗均需做標(biao)(biao)準品對照并畫出標(biao)(biao)準曲線。

3.分(fen)別將(jiang)標(biao)本(ben)或(huo)不(bu)同濃度(du)標(biao)準(zhun)品(pin)(100ul/孔)加(jia)(jia)入相應孔中，用封(feng)板(ban)膠紙封(feng)住反應孔，室溫孵育120分(fen)鐘(zhong)。對于(yu)血清(qing)或(huo)血漿(jiang)標(biao)本(ben)，請(qing)加(jia)(jia)入50ul樣(yang)(yang)本(ben)分(fen)析(xi)緩沖(chong)液后(hou)加(jia)(jia)50ul標(biao)本(ben)，如(ru)稀(xi)釋量大，請(qing)將(jiang)樣(yang)(yang)本(ben)與樣(yang)(yang)本(ben)分(fen)析(xi)緩沖(chong)液等量加(jia)(jia)入，不(bu)足部(bu)分(fen)用標(biao)準(zhun)品(pin)稀(xi)釋液補充至(zhi)100ul。   

4.洗板(ban)5次，且(qie)zui后一次置厚吸水(shui)紙(zhi)上拍干(gan)。

5.加入生物素化抗(kang)體工作液(100ul/孔)。用封板(ban)膠紙封住(zhu)反應孔，室溫孵育60分鐘。  

6.洗板5次(ci)，且zui后一次(ci)置(zhi)厚吸水紙上拍干。

7.加入酶結合物(wu)工(gong)作液(100ul/孔)。用封(feng)板膠紙封(feng)住(zhu)反應孔，避(bi)光室(shi)溫孵(fu)育20分鐘。

8.洗板5次，且zui后一次置(zhi)厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫孵(fu)育20分鐘(zhong)。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD₄₅₀值。

結果(guo)判斷:

1.復孔的值在(zai)20%的差異范圍內結果才有效，復孔的值平均(jun)后可(ke)作為測量值。

2.每個標(biao)準品或標(biao)本的(de)OD值應減去本底校(xiao)正孔的(de)OD值。

3.手工繪制標(biao)(biao)(biao)準曲線(xian)(xian)。以標(biao)(biao)(biao)準品濃度(du)(du)作(zuo)橫坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)(biao)，OD值作(zuo)縱坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)(biao)，以平滑(hua)線(xian)(xian)連接各標(biao)(biao)(biao)準品的坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)(biao)點。通過標(biao)(biao)(biao)本(ben)的OD值可在標(biao)(biao)(biao)準曲線(xian)(xian)上查出其濃度(du)(du)。

4.若標(biao)本OD值高于標(biao)準曲(qu)線(xian)上限，應(ying)適當稀(xi)釋(shi)后重(zhong)測(ce)，計算濃度時應(ying)乘以稀(xi)釋(shi)倍數。

典型數值和參考曲線