人基質金屬蛋白酶9(MMP-9)  Elisa試劑盒說明書

                       

預(yu)期應用(yong)

ELISA法定量測定人血清(qing)、血漿或其它相關生物液(ye)體中MMP-9含量。

實(shi)驗原理

用純化(hua)的(de)MMP-9抗體包被微(wei)孔(kong)板(ban)，制成固相載體，往微(wei)孔(kong)中依次加(jia)入標本(ben)或標準品(pin)、生物(wu)素化(hua)的(de)MMP-9抗體、HRP標記的(de)親和素，經過*洗滌后用底物(TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP-9呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（值），計算樣品濃度。

試(shi)劑(ji)盒組成及(ji)試(shi)劑(ji)配制

1、 酶(mei)標板：一塊（96孔）

2、 標(biao)準品(pin)(pin)(pin)（凍干(gan)品(pin)(pin)(pin)）： 2瓶，請臨用(yong)前15分鐘內(nei)配制。每瓶以(yi)樣品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋(shi)液稀(xi)釋(shi)至(zhi)1ml，蓋好后室溫(wen)靜置大約(yue)10分鐘，同(tong)時(shi)反復顛倒/搓動(dong)以(yi)助溶解(jie)，其(qi)濃(nong)度為5,000 pg/ml，然后做系列倍比稀(xi)釋(shi)（注：不(bu)要(yao)直接(jie)在板(ban)中(zhong)(zhong)進行(xing)倍比稀(xi)釋(shi)），分別(bie)配制成5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml，樣品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋(shi)液直接(jie)作為空白孔 0 pg/ml。如配制2,500 pg/ml標(biao)準品(pin)(pin)(pin)：取0.5ml （不(bu)要(yao)少于0.5ml ）5,000 pg/ml的上(shang)述標(biao)準品(pin)(pin)(pin)加(jia)入含有0.5ml樣品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋(shi)液的Eppendorf管中(zhong)(zhong)，混勻即可(ke)，其(qi)余濃(nong)度以(yi)此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測(ce)稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

6、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100/孔），實際配制時應多配制  0.1-0.2ml。

7、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8、 底物(wu)溶液：1×10ml/瓶(ping)。

9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶(ping)，使用(yong)時每瓶(ping)用(yong)蒸餾水稀釋25倍。

10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H₂SO₄）。

11、覆膜：5張(zhang)

12、使用說明書(shu)：1份

自備物(wu)品

1、 酶標儀(yi)（建議(yi)儀(yi)器(qi)使用前提前預熱）

2、 微量加液器及吸頭，EP管

3、 蒸餾水或去(qu)離子水，濾紙

標本的采集及保存

1、 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4置夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清(qing)置于(yu)-20或-80保存，但應避免反復凍融。

2、 血漿：可用EDTA或肝(gan)素作為抗凝劑，標本(ben)采(cai)集后30分鐘內于 1000g離心15分鐘，取上清即可檢測，或(huo)將上清置于-20或-80保存，但應避免反復凍融。

3、 其它生物標本：請1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上(shang)清置于-20或-80保    存，但應避免反復凍融。

4、 樣本處理：血(xue)清或血(xue)漿標(biao)本推薦(jian)稀(xi)釋(shi)(shi)100-200倍。標(biao)本使(shi)用0.1 M 的(de)PBS稀(xi)釋(shi)(shi)（ PH=7.0-7.2）。

注：以上標本均應密封保存，4保存應小于1周，-20不應超過1個月，-80不應超過2個月；標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作(zuo)步(bu)驟

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37溶解；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。

1、 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ，余孔分別加標準品或待測樣品100，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37溫育2小時。為保證實驗結果有效

性，每次實驗請使用新的標準(zhun)品(pin)溶(rong)液(ye)。

2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100（臨用前配制），酶標板加上覆膜，37溫育1小時。

3、 棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。

4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100，加上覆膜，37溫育1小時。

5、 棄去孔(kong)內液體(ti)，甩(shuai)干，洗板(ban)5次(ci)，方法同步(bu)驟3。

6、 每孔加底物溶液90，酶標板加上覆膜37避光顯色（反應時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。

7、 每孔加終止溶液50，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物    液的加入順序相同。

8、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（值）。

注：

1、 試劑(ji)準(zhun)備(bei)：所有試劑(ji)在使用前(qian)應(ying)平衡(heng)至室溫(wen)，使用后請立即按照說明書要求保存試劑(ji)。實驗操作中(zhong)請使用一次性的吸頭，避免交(jiao)叉污(wu)染。

2、 加(jia)樣：加(jia)樣或加(jia)試劑時(shi)，*個孔與zui后一(yi)個孔加(jia)樣之間(jian)的時(shi)間(jian)間(jian)隔如果太大，將會導致不同(tong)的 “預溫(wen)育"時(shi)間(jian)，從而(er)明顯(xian)地影響(xiang)到測量值的準確性(xing)及重復(fu)性(xing)。一(yi)次(ci)加(jia)樣時(shi)間(jian)（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內。推(tui)薦設置復(fu)孔進行實驗。

3、 溫育：為防(fang)止(zhi)樣品蒸(zheng)發(fa)(fa)，實(shi)驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nei)，以避免(mian)液體蒸(zheng)發(fa)(fa)；洗板后(hou)應盡快進(jin)行下步(bu)操(cao)作，任(ren)何(he)時侯都應避免(mian)酶標板處(chu)于干燥(zao)狀態；同(tong)時應嚴(yan)格遵守給定(ding)的溫育時間和溫度。

4、 洗(xi)滌(di)：洗(xi)滌(di)過(guo)程(cheng)中(zhong)反應孔(kong)(kong)中(zhong)殘(can)留的(de)洗(xi)滌(di)液(ye)應在濾紙上(shang)拍(pai)干，勿將(jiang)濾紙直接放入反應孔(kong)(kong)中(zhong)吸水，同時要消(xiao)除板底殘(can)留的(de)液(ye)體和手指印(yin)，避免影響zui后(hou)的(de)酶標儀讀數。

5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配制使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請 配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10），以避免由于不準確稀  釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。

6、 反(fan)(fan)應時間的(de)控制：加入(ru)底物后請(qing)定時觀察反(fan)(fan)應孔的(de)顏色(se)變化（比如，每隔10分鐘），如顏色(se)較(jiao)深，請(qing)提前加入(ru)終(zhong)止液終(zhong)止反(fan)(fan)應，避免反(fan)(fan)應過(guo)強從(cong)而(er)影響酶(mei)標儀光密度讀數。

7、 底(di)物(wu)：底(di)物(wu)請避光保存(cun)，在儲存(cun)和溫育時避免強(qiang)光直接照射。

洗板(ban)方法

1、 手工洗(xi)板(ban)方法：將推薦的洗(xi)滌緩沖(chong)液(ye)至(zhi)少0.4ml注入孔內，浸(jin)泡(pao)1-2分鐘，吸去（不可觸(chu)及板(ban)壁）或甩掉酶(mei)標板(ban)內的液(ye)體，在實驗臺上鋪墊幾(ji)層(ceng)吸水(shui)紙(zhi)，酶(mei)標板(ban)朝下用力拍幾(ji)次(ci)；根據需要，重復此過程數(shu)次(ci)。

2、 自(zi)動洗(xi)板：如(ru)果有(you)自(zi)動洗(xi)板機，應在(zai)熟練(lian)使用后再用到正(zheng)式實驗過(guo)程中。

特異性

    本試(shi)劑(ji)盒可同時檢(jian)測(ce)重(zhong)組或天然(ran)的人MMP-9，且與其它相(xiang)關蛋白(bai)無交叉反應。

計算

  各標準品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點圖），如設置復孔，則 應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數坐標），值為橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據樣品值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

檢測范圍：78 pg/ml - 5,000 pg/ml，繪制(zhi)標準曲線(xian)請(qing)取用(yong)以下濃度(du)值：5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml。

zui低檢測限：19.5 pg/ml

說明

1、  由于現有(you)條(tiao)件(jian)及科學技術水平尚不能對所有(you)供(gong)貨商提供(gong)的所有(you)原料(liao)進行(xing)全面的鑒定與分析，

    本產品可(ke)能存在一定的質(zhi)量(liang)技術風險(xian)。

2、  zui終(zhong)的(de)實(shi)驗結果與試劑的(de)有效性、實(shi)驗者的(de)相(xiang)(xiang)關(guan)操作(zuo)以及(ji)當時的(de)實(shi)驗環境密切相(xiang)(xiang)關(guan)，請務必

準備充足的標本備份。

3、 只有(you)全部使用原本試劑(ji)才能保證檢(jian)(jian)測效果(guo)(guo)，因為所(suo)有(you)試劑(ji)都是有(you)關(guan)聯的，不能混用其他制造商的產品(pin)。只有(you)嚴(yan)格(ge)遵守本試劑(ji)的實(shi)驗說明才會得到*的檢(jian)(jian)測結果(guo)(guo)。

4、 在(zai)儲存(cun)及溫育過(guo)程中(zhong)避免將試劑(ji)暴露在(zai)強(qiang)光中(zhong)。所有試劑(ji)瓶蓋須(xu)蓋緊以防止蒸發和微生物的(de)   污染，因為蛋白水解酶的(de)干擾將導(dao)致(zhi)出現錯誤的(de)結(jie)果。

5、 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20，其余試劑短期保存請置于4，長期保存則置于-20。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于-20，避免潮濕。

6、 濃洗滌液(ye)會有鹽(yan)析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

7、 剛開啟的(de)酶聯板孔中可能會有少許水樣(yang)物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成(cheng)任何(he)影(ying)響。

8、 有效期(qi)：6個月。

9、 本操作(zuo)說明適(shi)用(yong)于48T試劑盒，但(dan)48T試劑盒所有(you)試劑減(jian)半。