人(ren)基質金(jin)屬蛋白酶2(MMP-2)ELISA試劑盒說明書

              

 本(ben)試劑盒僅供(gong)體外研究使用、不(bu)用于臨床(chuang)診斷!  

預(yu)期應用(yong)

ELISA法定量(liang)(liang)測定人血(xue)清、血(xue)漿或其它(ta)相關生物液(ye)體(ti)中MMP-2含(han)量(liang)(liang)。

實(shi)驗原理(li)

用純化的MMP-2抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的MMP-2抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物(TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP-2呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（值），計算樣品濃度。

試(shi)劑盒(he)組成及試(shi)劑配制

1、 酶標板：一塊(kuai)（96孔）

2、 標準品(pin)（凍干(gan)品(pin)）： 2瓶，請臨用前(qian)15分(fen)鐘內配制。每(mei)瓶以(yi)樣(yang)品(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)(ye)稀(xi)釋(shi)至1ml，蓋好后室溫靜置(zhi)大約10分(fen)鐘，同時反復顛倒/搓動以(yi)助溶解，其濃度(du)為20 ng/ml，然后做(zuo)系列(lie)倍比(bi)稀(xi)釋(shi)（注：不要直接在板(ban)中進行倍比(bi)稀(xi)釋(shi)），分(fen)別配制成(cheng)20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，樣(yang)品(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)(ye)直接作(zuo)為空白孔 0 ng/ml。如配制10 ng/ml標準品(pin)：取0.5ml （不要少于0.5ml ）20 ng/ml的(de)(de)上述標準品(pin)加入(ru)含有0.5ml樣(yang)品(pin)稀(xi)釋(shi)液(ye)(ye)的(de)(de)Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度(du)以(yi)此類推(tui)。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液(ye)A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

6、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100/孔），實際配制時應多配制  0.1-0.2ml。

7、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8、 底物溶液：1×10ml/瓶。

9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使(shi)用時每瓶用蒸(zheng)餾(liu)水稀(xi)釋25倍(bei)。

10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H₂SO₄）。

11、覆(fu)膜：5張

12、使用說明書：1份

自備物品

1、 酶標儀（建議儀器使用前(qian)(qian)提(ti)前(qian)(qian)預熱）

2、 微量加液器及吸頭，EP管

3、 蒸餾水或去(qu)離(li)子水，濾(lv)紙

標本的采集(ji)及保存

1、 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4置夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20或-80保存，但應避免反復凍融。

2、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于 1000g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20或-80保存，但應避免反復凍融。

3、 其它生物標本：請1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20或-80保    存，但應避免反復凍融。

4、 樣本處理：血清(qing)或血漿(jiang)標本推薦(jian)稀釋100倍(bei)，如(ru)：稀釋100倍(bei)，取10uL血清(qing)或血漿(jiang)加(jia)入990uL樣品稀釋液(ye)。標本使用0.1 M 的PBS稀釋（ PH=7.0-7.2）。

注：以上標本均應密封保存，4保存應小于1周，-20不應超過1個月，-80不應超過2個月；標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操(cao)作步驟

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37溶解；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。

1、 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ，余孔分別加標準品或待測樣品100，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37溫育2小時。為保證實驗結果有效

性，每次實驗請使用新的標準品溶液(ye)。

2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100（臨用前配制），酶標板加上覆膜，37溫育1小時。

3、 棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。

4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100，加上覆膜，37溫育1小時。

5、 棄去孔(kong)內液體，甩干，洗(xi)板5次，方法(fa)同步驟3。

6、 每孔加底物溶液90，酶標板加上覆膜37避光顯色（反應時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。

7、 每孔加終止溶液50，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物    液的加入順序相同。

8、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（值）。

注：

1、 試(shi)(shi)劑(ji)(ji)準備：所(suo)有(you)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)在使(shi)用前應平衡至室溫，使(shi)用后(hou)請(qing)立即按(an)照說明書要求保存試(shi)(shi)劑(ji)(ji)。實驗操作(zuo)中(zhong)請(qing)使(shi)用一次(ci)性的吸頭，避免交叉污染。

2、 加(jia)(jia)樣(yang)(yang)：加(jia)(jia)樣(yang)(yang)或加(jia)(jia)試劑時(shi)，*個孔與zui后一個孔加(jia)(jia)樣(yang)(yang)之間(jian)(jian)的時(shi)間(jian)(jian)間(jian)(jian)隔如果太大，將會導致不(bu)同的 “預溫育"時(shi)間(jian)(jian)，從而明顯地影響到測量(liang)值的準確性及(ji)重復性。一次加(jia)(jia)樣(yang)(yang)時(shi)間(jian)(jian)（包(bao)括(kuo)標準品及(ji)所(suo)有樣(yang)(yang)品）控制(zhi)在10分(fen)鐘內(nei)。推薦(jian)設置復孔進行實驗。

3、 溫育：為防止(zhi)樣(yang)品蒸(zheng)發，實驗時將加(jia)上蓋或覆膜的酶標(biao)板置于濕盒內，以(yi)避免(mian)液體蒸(zheng)發；洗板后應(ying)盡快進行下步操作，任(ren)何(he)時侯都應(ying)避免(mian)酶標(biao)板處于干燥狀態；同時應(ying)嚴格遵守給定(ding)的溫育時間(jian)和溫度(du)。

4、 洗滌：洗滌過程(cheng)中反(fan)應孔(kong)中殘留的洗滌液(ye)應在(zai)濾紙(zhi)上拍干，勿將濾紙(zhi)直接放入反(fan)應孔(kong)中吸水，同時(shi)要消除板底(di)殘留的液(ye)體和手指印，避免影(ying)響zui后的酶(mei)標儀(yi)讀(du)數。

5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配制使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請 配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10），以避免由于不準確稀  釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。

6、 反(fan)應時間(jian)的控制(zhi)：加入(ru)底物后請定時觀察(cha)反(fan)應孔的顏(yan)色變(bian)化(hua)（比如(ru)，每隔10分鐘），如(ru)顏(yan)色較(jiao)深(shen)，請提(ti)前加入(ru)終(zhong)止液終(zhong)止反(fan)應，避免反(fan)應過強從而影(ying)響酶標儀光密度讀數。

7、 底物：底物請避光保(bao)存(cun)，在儲(chu)存(cun)和溫育時避免強光直接(jie)照(zhao)射。

洗板方法

1、 手工洗板方法：將推薦(jian)的洗滌緩沖液(ye)至少0.4ml注入孔(kong)內，浸(jin)泡(pao)1-2分鐘，吸(xi)去（不可(ke)觸及(ji)板壁）或甩掉酶標板內的液(ye)體，在(zai)實驗臺(tai)上鋪墊幾(ji)層(ceng)吸(xi)水(shui)紙，酶標板朝下用力(li)拍幾(ji)次；根據需(xu)要(yao)，重復(fu)此過程數次。

2、 自動(dong)洗(xi)板：如果有自動(dong)洗(xi)板機，應在熟練使(shi)用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同(tong)時檢測重組或(huo)天然的人MMP-2，且與其它相關蛋白無交叉反應。

計(ji)算

  各標準品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點圖），如設置復孔，則 應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數坐標），值為橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據樣品值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

檢測范圍：0.312 ng/ml - 20 ng/ml，繪制(zhi)標準(zhun)曲(qu)線請(qing)取用以下濃度(du)值：20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml。

zui低檢測限(xian)：0.078 ng/ml

說明(ming)

1、  由于現有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的(de)所有原料進行(xing)全面的(de)鑒定與分析，

    本產品可能(neng)存在一定的質(zhi)量技術風險。

2、  zui終的(de)實(shi)驗(yan)結果(guo)與試(shi)劑(ji)的(de)有效性、實(shi)驗(yan)者的(de)相關操作以及當時的(de)實(shi)驗(yan)環境(jing)密切相關，請(qing)務必(bi)

準備(bei)(bei)充足的標本備(bei)(bei)份。

3、 只有(you)(you)(you)全部使用本盒試(shi)(shi)劑才能(neng)保(bao)證檢(jian)測效果(guo)，因為所有(you)(you)(you)試(shi)(shi)劑都是有(you)(you)(you)關(guan)聯的(de)(de)，不(bu)(bu)能(neng)混用其(qi)他(ta)制造(zao)商的(de)(de)產品。只有(you)(you)(you)嚴格遵守本盒試(shi)(shi)劑的(de)(de)實(shi)驗(yan)說明才會得到*的(de)(de)檢(jian)測結果(guo)。如果(guo)由(you)于實(shi)驗(yan)者的(de)(de)操(cao)作(zuo)失誤(wu)或(huo)試(shi)(shi)劑盒保(bao)存不(bu)(bu)當(dang)導致(zhi)結果(guo)不(bu)(bu)佳，不(bu)(bu)屬產品質(zhi)量問題。

4、 在儲存及溫(wen)育過程(cheng)中避免(mian)將試(shi)劑暴露在強光(guang)中。所(suo)有試(shi)劑瓶(ping)蓋須蓋緊以防(fang)止蒸發和(he)微生物(wu)的   污染，因為蛋白水解(jie)酶的干擾將導致出現錯誤的結(jie)果。

5、 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20，其余試劑短期保存請置于4，長期保存則置于-20。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于-20，避免潮濕。

6、 濃洗滌(di)液會有鹽析出，稀釋時可(ke)在水浴中加溫助溶。

7、 剛開啟的酶(mei)聯板孔中可能會有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成(cheng)任何影(ying)響(xiang)。

8、 有效期：6個(ge)月。

9、 本操作說明適用于48T試劑(ji)盒(he)，但48T試劑(ji)盒(he)所有(you)試劑(ji)減(jian)半。