人腸三葉因子(ITF)ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用(yong)

檢測范圍：15.6 ng/g -1000 ng/g

zui低檢測限：3.9 ng/g

特異性：本(ben)試劑盒可同時檢測(ce)天然或重(zhong)組的人(ren)ITF，且與其(qi)他(ta)相(xiang)關蛋白無交叉反應。

有(you)效期(qi)：6個月(yue)

預期應用：ELISA法定(ding)(ding)量測定(ding)(ding)人血(xue)清、血(xue)漿、細胞培養(yang)上(shang)清或其它相關生物液體中ITF含量。

說(shuo)明

1．試劑盒保存：-20℃（較長(chang)時間不用時）；2-8℃（頻繁使(shi)用時）。

2．濃洗滌(di)液(ye)低溫保存會有鹽析出，稀釋時(shi)可在水浴中加(jia)溫助(zhu)溶。

3．中、英文(wen)說(shuo)(shuo)明書可能會有不一致之(zhi)處，請以英文(wen)說(shuo)(shuo)明書為(wei)準。

4．剛開啟的酶聯板孔中(zhong)可能會(hui)含有(you)少許水樣物質，此為正常(chang)現象，不會(hui)對實(shi)驗結(jie)果造成任何影響(xiang)。

實驗原(yuan)理

用純(chun)化的抗體(ti)包被(bei)微孔(kong)板，制成固相載體(ti)，往(wang)包被(bei)抗ITF抗體(ti)的微孔中(zhong)依次加入標本(ben)或標準品、生物素化的抗ITF抗(kang)體、HRP標記的親和素，經(jing)過*洗滌后用底(di)物TMB顯色。TMB在過氧(yang)化(hua)(hua)物酶的催(cui)化(hua)(hua)下轉化(hua)(hua)成藍色，并(bing)在酸的作用下轉化(hua)(hua)成zui終的黃色。顏(yan)色的深淺和樣品中(zhong)的ITF呈正(zheng)相關。用酶(mei)標儀在450nm波長下(xia)測定吸(xi)光度（OD值），計算樣(yang)品濃(nong)度。

試(shi)劑盒組成及試(shi)劑配制

1. 酶聯板(ban)(Assay plate )：一塊（96孔(kong)）。
2. 標準品（Standard）：2瓶(凍干品)。
3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶(ping)。
4. 生(sheng)物素(su)標記抗體稀(xi)釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣(la)根(gen)過(guo)氧(yang)化物酶標記親(qin)和素稀釋(shi)液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶(ping)。
6. 生物素(su)標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶(ping)（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 濃洗(xi)滌(di)液(ye)（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使(shi)用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍(bei)。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的試劑和器材(cai)

1. 標準規格(ge)酶(mei)標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫(wen)培養箱
4. 干凈(jing)的試管和Eppendof管(guan)
5. 系列可調節移液(ye)器(qi)及吸頭，一次檢(jian)測樣品較多時(shi)，用多通道(dao)移液(ye)器(qi)

6.    蒸餾水，容(rong)量(liang)瓶等

標本(ben)的采集及保存

1. 血(xue)清：全血(xue)標本請(qing)于室溫放置2小時或4℃置夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可(ke)檢測，或將標本(ben)放于-20℃或-80℃保存(cun)，但應避(bi)免反復凍(dong)融。
2. 血(xue)漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nei)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘(zhong)，或將標(biao)本放于-20℃或-80℃保(bao)存(cun)，但應避免反(fan)復凍融。
3. 細胞培養物(wu)上清或其(qi)它生(sheng)物(wu)標本(ben)：1000 x g離心20分鐘，取上清(qing)即可檢(jian)測，或(huo)將(jiang)標本放(fang)于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍(dong)融。

注：標(biao)本溶(rong)血會影(ying)響(xiang)zui后檢測結果，因此(ci)溶(rong)血標(biao)本不宜進行(xing)此(ci)項(xiang)檢測。

標本的稀釋原(yuan)則：

首先通(tong)過(guo)文獻檢索的(de)方式了解待測(ce)樣本的(de)大致含量，確定適當的(de)稀釋倍(bei)數(shu)。只有稀釋至標(biao)準曲(qu)線(xian)的(de)范圍內，檢測(ce)的(de)結果才是準確的(de)。稀釋的(de)過(guo)程中，應做好詳細的(de)記錄。zui后(hou)計算濃度時，稀釋了“N"倍，標本(ben)的(de)濃度(du)應再乘以(yi)“N"。

標準品(pin)的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣(yang)品稀釋液(ye)稀釋至1ml，蓋好后靜置(zhi)10分鐘以上，然后反(fan)復顛倒/搓動以助溶(rong)解，其(qi)濃(nong)度為1000 ng/g，做(zuo)系列倍比稀釋后，分別稀釋1000 ng/g，500 ng/g，250 ng/g，125 ng/g，62.5 ng/g，31.2 ng/g，15.6 ng/g，樣品稀釋液直接作(zuo)為標準濃度0 ng/g，臨(lin)用前15分(fen)鐘內配制(zhi)。

如(ru)配制500 ng/g標準品：取0.5ml（不要少(shao)于0.5ml）1000 ng/g的上述標(biao)準品加入含0.5ml樣品(pin)稀釋(shi)液的Eppendorf管中，混勻即可(ke)，其余濃度(du)以此類推(tui)。

生物素標記抗(kang)體(ti)的稀釋原則：

臨用前以生物素標記抗(kang)體(ti)稀(xi)(xi)釋液稀(xi)(xi)釋，稀(xi)(xi)釋前根據預先計算好(hao)的(de)每(mei)次實(shi)驗所需的(de)總量(liang)配制（每(mei)孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如(ru)10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體(ti)稀釋液(ye)的(de)比(bi)例配制(zhi)，輕輕混勻，在使用前一(yi)小時內配制(zhi)。

辣根(gen)過氧化物酶標(biao)記親和素的稀釋(shi)原則：

臨用前以辣(la)根過氧化物酶標記親(qin)和(he)素稀釋(shi)液稀釋(shi)，稀釋(shi)前根據預先計算好的(de)每(mei)次實驗所需的(de)總量配(pei)制（每(mei)孔100μl），實際(ji)配制(zhi)時應多(duo)配制(zhi)0.1-0.2ml。如10μl辣(la)根過氧(yang)化物(wu)酶標記親(qin)和素加(jia)990μl辣根過氧(yang)化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在(zai)使用前一(yi)小時內配制。

操作步驟(zou)

實驗(yan)開(kai)始前(qian)，請提前(qian)配(pei)置好所有試(shi)劑，試(shi)劑或(huo)樣品稀(xi)釋(shi)時，均(jun)需混勻，混勻時盡量避免起(qi)泡。每次檢測都應該(gai)做標準曲線。如樣品濃度(du)過高時，用樣品稀(xi)釋(shi)液(ye)進(jin)行稀(xi)釋(shi)，以使(shi)樣品符合試(shi)劑盒的檢測范圍(wei)。

1. 加樣(yang)：分別設空(kong)白孔(kong)(kong)(kong)、標準孔(kong)(kong)(kong)、待測樣(yang)品孔(kong)(kong)(kong)。空(kong)白孔(kong)(kong)(kong)加樣品稀釋液(ye)100μl，余(yu)孔分別加標準(zhun)品(pin)或待測(ce)樣品(pin)100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biao)板孔底(di)部，盡(jin)量不觸及孔壁(bi)，輕輕晃動混勻，酶標(biao)板加上蓋或覆膜，37℃反(fan)應(ying)120分鐘。

為保證實驗(yan)結果(guo)有效性，每次(ci)實驗(yan)請使用新(xin)的標(biao)準品溶液(ye)。

1. 棄去液體(ti)，甩干，不用洗滌。每孔加(jia)生物(wu)素標記(ji)抗體(ti)工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生(sheng)物素標記抗體稀釋液的(de)比例配(pei)(pei)制，輕(qing)輕(qing)混勻，在使(shi)用前一(yi)小時內配(pei)(pei)制），37℃,60分鐘(zhong)。
2. 溫育60分鐘(zhong)后，棄去孔(kong)內液體，甩干，洗板3次(ci)，每次(ci)浸泡(pao)1-2分(fen)鐘(zhong)，350μl/每孔，甩干(gan)。
3. 每(mei)孔加辣根過氧化(hua)物(wu)酶標(biao)記(ji)親和素工作液(ye)（同生物(wu)素標(biao)記(ji)抗(kang)體工作液(ye)） 100μl，37℃，60分鐘。
4. 溫育60分(fen)鐘后，棄去孔內液體(ti)，甩干，洗板5次(ci)，每次(ci)浸泡1-2分鐘，350μl/每(mei)孔，甩干。
5. 依序(xu)每孔加底物溶液(ye)90μl，37℃避(bi)光顯色（30分鐘內(nei)，此(ci)時(shi)肉眼可見標準品的(de)前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔(kong)梯度不(bu)明顯(xian)，即可終止）。
6. 依序每孔加終止溶(rong)液50μl，終止(zhi)反應(ying)(ying)（此時藍色立(li)轉黃色）。終止(zhi)液的(de)(de)加(jia)(jia)入(ru)順序應(ying)(ying)盡(jin)量與底(di)物液的(de)(de)加(jia)(jia)入(ru)順序相同(tong)。為了保證實驗結果的(de)(de)準確性，底(di)物反應(ying)(ying)時間到(dao)后(hou)應(ying)(ying)盡(jin)快加(jia)(jia)入(ru)終止(zhi)液。
7. 用(yong)酶聯儀(yi)在450nm波長依序測量各孔的光密(mi)度(du)（OD值(zhi)）。 在加終止液(ye)后15分鐘以內進行檢測。

注：

1. 用戶在(zai)初(chu)次使用試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒時，應將各種試(shi)(shi)劑(ji)(ji)管離心數分鐘，以便試(shi)(shi)劑(ji)(ji)集中到管底。

2. 每(mei)次實驗留一(yi)孔作為空白調零孔，該孔不加任(ren)何試劑，只是zui后加底物溶(rong)液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調OD值至零。

3. 為(wei)防(fang)止樣品蒸(zheng)發，試驗時將反應板放(fang)于(yu)鋪有(you)濕布的密(mi)閉盒(he)內，酶標(biao)板加上蓋或覆膜。

4. 未使用(yong)完(wan)的酶標板或(huo)者(zhe)試劑，請于2-8℃保存(cun)。標(biao)準品、生(sheng)物素標(biao)記(ji)抗體(ti)工作(zuo)液、辣(la)根(gen)過(guo)(guo)氧化(hua)物酶標(biao)記(ji)親和素工作(zuo)液請(qing)依據所(suo)需的(de)(de)量配置使用。請(qing)勿重復使用已稀釋過(guo)(guo)的(de)(de)標(biao)準品、生(sheng)物素標(biao)記(ji)抗體(ti)工作(zuo)液或、辣(la)根(gen)過(guo)(guo)氧化(hua)物酶標(biao)記(ji)親和素工作(zuo)液。

5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定(ding)，以保(bao)證檢測結果的準(zhun)確性。

洗板方(fang)法
手(shou)工洗板(ban)方法：吸(xi)去(qu)（不可觸(chu)及板(ban)壁）或甩掉酶標(biao)板(ban)內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸(xi)水紙，酶標(biao)板(ban)朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸(jin)泡1-2分(fen)鐘。根(gen)據(ju)需要(yao)，重復此過程數次。
自動洗(xi)板(ban)：如果有自動洗(xi)板(ban)機，應在熟練使(shi)用后再(zai)用到正(zheng)式(shi)實驗過程中。

計算

以標(biao)準(zhun)物的濃度為橫坐(zuo)標(biao)（對數坐(zuo)標(biao)），OD值為(wei)縱坐標（普(pu)通(tong)坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值(zhi)由標準(zhun)曲(qu)線查出相應(ying)的(de)濃(nong)度；再乘以(yi)稀釋倍數；或用標準(zhun)物的(de)濃(nong)度與(yu)OD值計(ji)算出標準曲線的直線回歸方程式，將(jiang)樣品(pin)的OD值代入(ru)方程式，計算出(chu)樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際(ji)濃度。

注意事項

1. 當(dang)混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌(di)過程非(fei)常重要，不充分的洗滌(di)易造(zao)成假陽性。

3. 一次加樣時間控制(zhi)在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用(yong)排槍加樣。

4. 請每次(ci)測定(ding)的(de)同時做(zuo)標準(zhun)曲線，做(zuo)復孔。

5. 如標本中待(dai)測物質(zhi)含量過高，請(qing)先稀(xi)釋后再測定，計算時請(qing)zui后乘以稀(xi)釋倍數(shu)。

6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相(xiang)應的(de)稀釋液配制，不(bu)能混淆(xiao)。

7. 底物請避(bi)光保存(cun)。

8. 不要(yao)用其它生產廠家(jia)的試(shi)劑(ji)替換試(shi)劑(ji)盒中(zhong)的試(shi)劑(ji)。