人苯并芘(bi)-DNA（PAH-DNA）ELISA試(shi)劑盒說明書

           

本試劑僅供研究使(shi)用       

目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關液體樣本中苯并芘-DNA（PAH-DNA）的含量。

實驗原理：

   本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人苯并芘-DNA（PAH-DNA）水平。用純化的人苯并芘-DNA（PAH-DNA）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入苯并芘-DNA（PAH-DNA），再與HRP標記的苯并芘-DNA（PAH-DNA）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人苯并芘-DNA（PAH-DNA）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人苯并芘-DNA（PAH-DNA）濃度。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分(fen)鐘，離心20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收集上清，保存過程中如出(chu)現沉淀，應再(zai)次離心。

2. 血(xue)漿(jiang)：應(ying)根據標本(ben)的要(yao)求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合(he)10-20分(fen)鐘(zhong)后，離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集上清，保(bao)存過程中如有沉淀形成，應(ying)該再次(ci)離(li)心。

3. 尿(niao)液(ye)：用無(wu)菌管收集(ji)(ji)，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔(zi)細(xi)收集(ji)(ji)上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水(shui)、腦脊液(ye)參(can)照實行(xing)。

4. 細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)培養上清：檢測分(fen)泌性的成(cheng)(cheng)(cheng)份(fen)(fen)時，用無菌管收集(ji)。離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)收集(ji)上清。檢測細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)內的成(cheng)(cheng)(cheng)份(fen)(fen)時，用PBS（PH7.2-7.4）稀(xi)釋(shi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)懸(xuan)液，細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)濃度達到100萬/ml左右。通過(guo)反復凍融(rong)，以使細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)破壞并(bing)放出細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)內成(cheng)(cheng)(cheng)份(fen)(fen)。離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)收集(ji)上清。保(bao)存過(guo)程(cheng)中如(ru)有沉淀(dian)形成(cheng)(cheng)(cheng)，應再次(ci)離(li)心。

5. 組織標(biao)本(ben)：切割標(biao)本(ben)后，稱(cheng)取重(zhong)量(liang)。加入(ru)一(yi)定量(liang)的(de)PBS，PH7.4。用(yong)液氮(dan)迅速冷凍保(bao)存備用(yong)。標(biao)本(ben)融化后仍然保(bao)持2-8℃的(de)溫度。加入(ru)一(yi)定量(liang)的(de)PBS（PH7.4），用(yong)手工或勻漿器將標(biao)本(ben)勻漿充分(fen)(fen)。離心20分(fen)(fen)鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分(fen)(fen)）。仔(zi)細收(shou)集上清。分(fen)(fen)裝后一(yi)份待檢(jian)測，其余冷凍備用(yong)。

6. 標本(ben)(ben)采集(ji)后(hou)盡早進(jin)行提(ti)取，提(ti)取按相關文獻進(jin)行，提(ti)取后(hou)應盡快進(jin)行實驗。若不(bu)能馬上進(jin)行試驗，可將標本(ben)(ben)放于(yu)-20℃保存(cun)，但應避免反(fan)復凍融.

7. 不能檢(jian)測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣(la)根過(guo)氧化物酶(mei)的（HRP）活性(xing)。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在*、第二孔中分別加標準品100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/L，15 ng/L）。
2. 加(jia)(jia)樣(yang)：分別設空白孔(kong)(kong)(kong)（空白對照(zhao)孔(kong)(kong)(kong)不(bu)加(jia)(jia)樣(yang)品(pin)及酶標(biao)試劑，其余(yu)各步操作相同）、待測(ce)樣(yang)品(pin)孔(kong)(kong)(kong)。在酶標(biao)包被板上待測(ce)樣(yang)品(pin)孔(kong)(kong)(kong)中先加(jia)(jia)樣(yang)品(pin)稀(xi)釋液40μl，然后再加(jia)(jia)待測(ce)樣(yang)品(pin)10μl（樣(yang)品(pin)zui終稀(xi)釋度(du)為5倍(bei)）。加(jia)(jia)樣(yang)將樣(yang)品(pin)加(jia)(jia)于(yu)酶標(biao)板孔(kong)(kong)(kong)底部，盡量不(bu)觸(chu)及孔(kong)(kong)(kong)壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板(ban)膜封板(ban)后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30（48T的20倍(bei)(bei)）倍(bei)(bei)濃(nong)縮洗滌液用(yong)蒸餾水30（48T的20倍(bei)(bei)）倍(bei)(bei)稀(xi)釋后(hou)備用(yong)。
5. 洗(xi)滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗(xi)滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
6. 加(jia)酶：每孔加(jia)入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操(cao)作同5。
9. 顯(xian)(xian)(xian)色(se)：每(mei)孔先加入顯(xian)(xian)(xian)色(se)劑A50μl，再加入顯(xian)(xian)(xian)色(se)劑B50μl，輕輕震蕩混(hun)勻，37℃避光顯(xian)(xian)(xian)色(se)15分(fen)鐘.
10. 終(zhong)止：每孔(kong)加終(zhong)止液50μl，終(zhong)止反應(ying)（此(ci)時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以(yi)空白(bai)空調零，450nm波(bo)長依序測量(liang)各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以(yi)內進行。

注意事項：

1. 試劑盒(he)從冷(leng)藏(zang)環境(jing)中(zhong)取出(chu)應在室(shi)溫平衡15-30分(fen)鐘后方(fang)可(ke)使用，酶標包被板(ban)開封后如未用完(wan)，板(ban)條應裝(zhuang)入(ru)密封袋(dai)中(zhong)保存。
2. 濃洗(xi)滌(di)液可能會(hui)有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗(xi)滌(di)時不影(ying)響(xiang)結果(guo)。
3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常(chang)校對其準確性，以避(bi)免試驗(yan)誤(wu)差。一次加樣時間(jian)控制在5分鐘內(nei)，如(ru)標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請(qing)每次測(ce)(ce)定的同(tong)時做標準曲線(xian)，做復(fu)孔(kong)。如(ru)標本中(zhong)待(dai)測(ce)(ce)物質含(han)量過高（樣本OD值大(da)于標準品孔(kong)*孔(kong)的OD值），請(qing)先用樣品稀釋(shi)液稀釋(shi)一定倍數(shu)(shu)（n倍）后再(zai)測(ce)(ce)定，計算時請(qing)zui后乘以(yi)總稀釋(shi)倍數(shu)(shu)（×n×5）。
5. 封板膜只限(xian)一次性使用，以避免交(jiao)叉污染。
6. 底物請避光保(bao)存。
7. 嚴格按(an)照說明書(shu)的操(cao)作進行，試驗結果判(pan)定必(bi)須以酶標(biao)儀(yi)讀數為(wei)準(zhun).
8. 所有(you)樣品，洗滌液和各種廢棄物都(dou)應(ying)按傳染物處(chu)理(li)。
9. 本(ben)試劑不(bu)同批號組(zu)分不(bu)得混用(yong)。

10. 如與英(ying)文(wen)說明書有異，以英(ying)文(wen)說明書為準。

計算：

以(yi)標準(zhun)物的(de)濃度(du)為(wei)(wei)橫(heng)坐標，OD值為(wei)(wei)縱坐標，   

在坐標(biao)紙上(shang)繪出標(biao)準曲(qu)線，根據樣品的OD     

值由標準曲線(xian)查(cha)出相應(ying)的(de)濃度；再乘(cheng)以(yi)稀(xi)釋     

倍數(shu)；或用(yong)標(biao)準物(wu)的(de)濃度與OD值計(ji)算(suan)出標(biao)     

準(zhun)曲線(xian)的直線(xian)回歸(gui)方程式，將樣(yang)品的OD值     

代入方程式，計(ji)算出樣品濃度，再乘以稀釋   ;  

倍(bei)數，即為樣品的實際濃度。                  

                                             

試劑盒性能：

1.樣品線(xian)性回歸與預期濃度(du)相關系數R值為0.95以上。

2.批內與批見應分別小于9%和11%

檢測范圍：                                             

10ng/L -200ng/L                                    

                           

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存(cun)：；2-8℃。

2．有(you)效期(qi)：6個月