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原代細胞(bao)鑒定
動物組(zu)織(zhi)是(shi)由多(duo)種類型的細(xi)胞(bao)(bao)組(zu)成的,包括表皮細(xi)胞(bao)(bao)、成纖維細(xi)胞(bao)(bao)、內皮細(xi)胞(bao)(bao)等。分離出(chu)的細(xi)胞(bao)(bao)是(shi)否是(shi)實驗所(suo)需類型的細(xi)胞(bao)(bao)則需要進行鑒(jian)定,除了基本的形態學(xue)(xue)觀察外zui常用的就是(shi)免疫組(zu)織(zhi)化(hua)學(xue)(xue)檢(jian)測。
操作步驟:
1. 將無(wu)菌(jun)的蓋(gai)玻(bo)片(pian)置(zhi)于細胞(bao)培(pei)養(yang)皿(min)中,將細胞(bao)懸液接種(zhong)于培(pei)養(yang)皿(min)中進行細胞(bao)爬(pa)片(pian),待細胞(bao)長至80%時取(qu)出(chu)爬(pa)片(pian)。
2. 用PBS浸洗爬(pa)片3次,4%的多聚甲醛固定爬(pa)片15min,再次用PBS浸洗玻片3次,每次3min。
3. 0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫孵育爬片(pian)20min,使細胞通(tong)透。
4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化(hua)物酶,室溫孵育(yu)15min(一般用甲醇(chun)或蒸餾(liu)水稀(xi)釋30%過氧化(hua)氫(qing)),PBS沖洗3次,每次3min。
5. 封閉血(xue)清室溫孵育20min,PBS沖洗3次(ci),每次(ci)3min。
6. 細胞特異性一抗(kang)(kang)孵(fu)育(yu):按照抗(kang)(kang)體說明書稀釋(shi)比例稀釋(shi)好一抗(kang)(kang),滴加在(zai)爬片上,于4°C濕盒中孵(fu)育(yu)隔夜,PBS沖洗(xi)3次,每次3min。
7. 二抗孵育:選與(yu)一抗對應的二抗,按比(bi)例稀釋(shi)后滴加在爬片上,37°C濕盒中孵育30min,PBS沖洗3次,每次3min。
8. 將爬(pa)片(pian)周圍水(shui)漬吸干,爬(pa)片(pian)上滴(di)加新鮮配制(zhi)的DAB顯(xian)(xian)色(se)液(ye),顯(xian)(xian)微(wei)鏡下觀察,當(dang)出現(xian)棕(zong)黃(huang)色(se)或(huo)棕(zong)褐色(se)的陽性(xing)信號(hao)時(shi)用蒸餾水(shui)沖洗終止(zhi)顯(xian)(xian)色(se)。
9. 復染:用Harris蘇木素復染30s~1min,水(shui)洗后用1%的鹽酸酒精分化,再用蒸餾(liu)水(shui)(或PBS)水(shui)洗返藍。
10. 封片:將中性樹膠滴在爬片一側,再用蓋(gai)玻(bo)片蓋(gai)上,先(xian)放平蓋(gai)玻(bo)片一側再輕(qing)輕(qing)放下(xia)另一側,以免(mian)產生氣泡,封好的爬片平放置(zhi)于通風(feng)廚中晾干(gan)。
11. 鏡檢觀察。
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