細(xi)胞培養(yang)常見(jian)問題及其解決

1、如何選用特殊細胞系培養基？

培養(yang)某一(yi)類型沒(mei)有固定的(de)(de)培養(yang)條(tiao)件。在MEM中培養(yang)的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)，很可能在DMEM或M199中同(tong)樣很容易生長。總(zong)之，MEM做粘附細(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)、RPMI-1640做懸浮(fu)細(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)是一個好的(de)(de)開始。

2、何時須更換培養基？

視細(xi)胞(bao)生長密度而定(ding)， 或(huo)遵照細(xi)胞(bao)株(zhu)基本數據(ju)上之更換(huan)時間，按時更換(huan)培養基即可(ke)。

3、可否使用與原先培養條件不同之培養基？

不能。每一(yi)細(xi)胞株均有其特定使用(yong)且已(yi)適應之細(xi)胞培養基， 若驟然使用(yong)和原先提供之培養條件(jian)不同之培養基， 細(xi)胞大都無法立即適應， 造(zao)成細(xi)胞無法存活(huo)。

4、可否使用與原先培養條件不同之種類？

不能。是細胞(bao)培養(yang)上(shang)一(yi)個極為重要(yao)的(de)營(ying)養(yang)來源，所以血清的(de)種類(lei)和品質對于細胞(bao)的(de)生長會(hui)產生極大的(de)影響。來自(zi)不(bu)同物(wu)種的(de)血清，在一(yi)些物(wu)質或(huo)分(fen)子的(de)量或(huo)內容(rong)物(wu)上(shang)都(dou)有所不(bu)同，血清使用錯(cuo)誤常會(hui)造(zao)成細胞(bao)無(wu)法存活(huo)。

5、何謂FBS, FCS, CS, HS ?

(fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指(zhi)(zhi)胎(tai)牛血清(qing)(qing)， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再(zai)使用。CS (calf serum) 則是指(zhi)(zhi)小牛血清(qing)(qing)。HS (horseserum) 則是指(zhi)(zhi)馬(ma)血清(qing)(qing)。

6、培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？

一般培(pei)養基(ji)中大都(dou)使用HCO3-/CO32-/H+ 作為(wei)pH 的緩沖系(xi)統， 而培(pei)養基(ji)中NaHCO3 的含量將決定培養(yang)時(shi)應使(shi)(shi)用(yong)的CO2 濃(nong)度。當培養(yang)基中(zhong)NaHCO3 含量為每公升(sheng)3.7 g 時(shi)，細(xi)胞培養(yang)時(shi)應使(shi)(shi)用(yong)10 % CO2；當培養(yang)基中(zhong)NaHCO3 為每公升(sheng)1.5 g 時(shi)， 則應使(shi)(shi)用(yong)5 % CO2 培養(yang)細(xi)胞。

7、Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別？

HBS和(he) EBS 的主要差別在于碳酸(suan)(suan)(suan)氫鈉的水(shui)平(ping),在Eagles (2.2g/L)中(zhong)(zhong)比在Hanks (0.35g/L) 中(zhong)(zhong)高(gao)。碳酸(suan)(suan)(suan)氫鈉需用高(gao)水(shui)平(ping)的CO2平(ping)衡，以(yi)維(wei)持溶液(ye)的PH值。Eagles液(ye)在空(kong)氣水(shui)平(ping)的CO2 中(zhong)(zhong)，溶液(ye)會變(bian)堿，Hanks液(ye)在CO2培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)(zhong)會變(bian)酸(suan)(suan)(suan)。如果希望在CO2培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)(zhong)保存組織，需要用Eagles液(ye)，。如果僅僅是(shi)清洗將(jiang)要在細胞培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)儲存的組織，用Hanks液(ye)就可(ke)以(yi)了。

8、細胞之接種密度為何？

依照細(xi)胞株(zhu)基(ji)本(ben)數(shu)據上(shang)之接(jie)(jie)種密(mi)度(du)或稀釋分盤(pan)之比(bi)例接(jie)(jie)種即可。細(xi)胞數(shu)太少(shao)或稀釋的太多亦是(shi)造成細(xi)胞無法生長(chang)之一(yi)重要(yao)原(yuan)因。

9、懸浮性細胞應如何繼代處理？

一般僅需(xu)持續加(jia)入新(xin)鮮(xian)培(pei)養(yang)(yang)基于原培(pei)養(yang)(yang)角瓶(ping)(ping)中(zhong)， 稀(xi)釋(shi)細胞濃度(du)即可(ke)(ke)， 若(ruo)培(pei)養(yang)(yang)液(ye)太多(duo)時， 可(ke)(ke)將培(pei)養(yang)(yang)角瓶(ping)(ping)口端稍微抬高， 直到無法(fa)容納為止(zhi)。分瓶(ping)(ping)時取出一部份含細胞之(zhi)培(pei)養(yang)(yang)液(ye)至另一新(xin)的培(pei)養(yang)(yang)角瓶(ping)(ping)， 加(jia)入新(xin)鮮(xian)培(pei)養(yang)(yang)基稀(xi)釋(shi)至適當(dang)濃度(du)， 重復(fu)前(qian)述步(bu)驟即可(ke)(ke)。

10、冷凍管應如何解凍？

取出冷凍(dong)管后(hou)， 須立(li)即放(fang)入37 °C 水(shui)槽中(zhong)快速解(jie)凍(dong)， 輕(qing)搖冷凍(dong)管使其在1 分鐘(zhong)內(nei)全部融(rong)化， 并(bing)注意水(shui)面(mian)不可超(chao)過冷凍(dong)管蓋沿， 否則易(yi)發(fa)生(sheng)污染(ran)情形。另冷凍(dong)管由(you)液氮桶中(zhong)取出解(jie)凍(dong)時(shi)， 必須注意安全， 預防冷凍(dong)管之爆(bao)裂(lie)。

11、細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO？

除(chu)少數(shu)特(te)別(bie)注明對DMSO 敏感(gan)之細(xi)胞(bao)(bao)外， 絕大(da)部分(fen)細(xi)胞(bao)(bao)株（包括懸浮性(xing)細(xi)胞(bao)(bao)）， 在(zai)解凍之后， 應直接放(fang)入含(han)有(you)10-15ml新鮮(xian)(xian)培養基之培養角瓶中， 待(dai)隔天再置(zhi)換(huan)新鮮(xian)(xian)培養基以(yi)去除(chu)DMSO 即可， 如此可避免大(da)部分(fen)解凍后細(xi)胞(bao)(bao)無法生長或(huo)貼附之問題(ti)。

12、附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？

一(yi)般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應立(li)即少(shao)量分(fen)裝于無菌試管中， 保存于–20 °C，避(bi)免反復冷(leng)凍(dong)解凍(dong)造成(cheng)trypsin 之活性(xing)降(jiang)低， 并(bing)可減少(shao)污染(ran)之機

13、欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

欲回收動(dong)物細胞， 其離(li)心速率一(yi)般(ban)為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過(guo)高之(zhi)轉(zhuan)速， 將造(zao)成細胞死亡。

14、細胞冷凍培養基之成份為何？

動物細(xi)胞(bao)冷凍(dong)保(bao)存(cun)時zui常使(shi)用(yong)的冷凍(dong)培(pei)養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原(yuan)來細(xi)胞(bao)生長用(yong)之新鮮培(pei)養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋(shi)時會放(fang)出大量熱能， 故不可(ke)將DMSO 直接加入(ru)細(xi)胞(bao)液(ye)中， 必(bi)須使(shi)用(yong)前先行配制完成(cheng)。

15、DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍(dong)保(bao)存使用(yong)之DMSO 等級， 必須為(wei)Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本(ben)身(shen)即為(wei)無(wu)菌狀況， *次開瓶后應(ying)立(li)即少量分裝于(yu)無(wu)菌試管中(zhong)， 保(bao)存于(yu)4°C， 避免反復冷凍(dong)解凍(dong)造成DMSO 之裂(lie)解而(er)釋出有(you)害(hai)物質， 并可減少污染(ran)之機會。若要過(guo)濾DMSO， 則(ze)須使用(yong)耐(nai)DMSO 之Nylon 材質濾膜(mo)。

16、冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存(cun)方(fang)法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分(fen)鐘(zhong)→ (-20 °C30 分(fen)鐘(zhong)*) → -80 °C 16~18 小(xiao)時(或(huo)隔(ge)夜(ye)) → 液氮槽vaporphase 長期儲存(cun)。

冷(leng)凍(dong)保存方(fang)法二(er): 冷(leng)凍(dong)管置于已設定程序之可程序降(jiang)(jiang)溫機中(zhong)每(mei)分鐘降(jiang)(jiang)1-3 °C 至–80 °C 以下(xia)， 再放(fang)入液氮槽vapor phase長期儲(chu)存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防(fang)止冰(bing)晶過大，造成細(xi)胞大量死亡，亦可跳(tiao)過此步(bu)驟(zou)直接(jie)放(fang)入-80°C 冰(bing)箱(xiang)中(zhong)，惟存活率稍微 降(jiang)(jiang)低一些。

17、細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

冷凍管內(nei)細胞(bao)數目一(yi)般為(wei)1x106 cells/ml vial， 融合(he)瘤(liu)細胞(bao)則以5x106 cells/ml vial 為(wei)宜(yi)。

18、培養基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tong)中外， 一般正常培(pei)養狀態(tai)下， 培(pei)養基中不應(ying)添加任何抗生素(su)。

19、應如何避免細胞污染？

細(xi)胞污(wu)染的種類可分成細(xi)菌(jun)(jun)(jun)、酵(jiao)母菌(jun)(jun)(jun)、霉菌(jun)(jun)(jun)、病毒和霉漿(jiang)菌(jun)(jun)(jun)。主要的污(wu)染原因為(wei)無(wu)菌(jun)(jun)(jun)操作技術不(bu)當、操作室環(huan)境(jing)不(bu)佳、污(wu)染之(zhi)(zhi)血清(qing)和污(wu)染之(zhi)(zhi)細(xi)胞等(deng)。嚴格之(zhi)(zhi)無(wu)菌(jun)(jun)(jun)操作技術、清(qing)潔的環(huan)境(jing)、與品質良好之(zhi)(zhi)細(xi)胞來源和培養基(ji)配制是(shi)減低(di)污(wu)染之(zhi)(zhi)方法。

20、如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？

原則上：直接滅(mie)菌(jun)后丟(diu)棄(qi)之。

當(dang)重要的培(pei)養(yang)污(wu)(wu)染(ran)(ran)時，研究(jiu)者(zhe)可(ke)能試(shi)圖消(xiao)除或控制污(wu)(wu)染(ran)(ran)。首先，確定(ding)污(wu)(wu)染(ran)(ran)物是細菌、真菌、支原體或酵母，把(ba)污(wu)(wu)染(ran)(ran)細胞與(yu)其它細胞系隔離開，用實驗(yan)室消(xiao)毒(du)劑消(xiao)毒(du)培(pei)養(yang)器(qi)皿(min)和超凈臺，檢(jian)查HEPA過濾(lv)器(qi)。

高濃度的(de)抗(kang)(kang)生(sheng)素和(he)抗(kang)(kang)霉(mei)(mei)菌素可能對一些細胞系有毒(du)性，因而，做劑量反應實(shi)驗確定抗(kang)(kang)生(sheng)素和(he)抗(kang)(kang)霉(mei)(mei)菌素產生(sheng)毒(du)性的(de)劑量水(shui)平。這點在使用抗(kang)(kang)生(sheng)素如(ru)兩性霉(mei)(mei)素B和(he)抗(kang)(kang)霉(mei)(mei)菌素如(ru)泰(tai)樂菌素時尤其重(zhong)要。下面是推薦的(de)確定毒(du)性水(shui)平和(he)消(xiao)除培養污染的(de)實(shi)驗步驟。

（1）無(wu)抗生素(su)的培養基中消化(hua)、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。

（2）分散細胞懸液到(dao)多孔培(pei)養(yang)板中(zhong)，或幾(ji)個(ge)小培(pei)養(yang)瓶中(zhong)。在一(yi)個(ge)濃(nong)度梯度范圍內，把選(xuan)擇抗生素加(jia)入到(dao)每一(yi)個(ge)孔中(zhong)。例如，兩(liang)性霉(mei)素B推薦下列濃(nong)度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

（3）每天觀(guan)測毒(du)性(xing)指(zhi)標，如脫落，出現空泡(pao)，匯合度(du)下降和變(bian)圓。

（4）確定抗生(sheng)素(su)毒(du)性水平后，使(shi)用低于毒(du)性濃度(du)2～3倍(bei)濃度(du)的抗生(sheng)素(su)的培養液培養細胞2～3代。

（5）在無抗生(sheng)素的(de)培養(yang)基(ji)中培養(yang)細胞(bao)一代。

（6）重(zhong)復步驟4。

（7）在無抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消(xiao)除。

21、支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？

不能。除極(ji)有經(jing)驗(yan)之專家外，大多(duo)數遭受支原體污染的細胞株(zhu)， 無法以其外觀分辨(bian)之。

22、支原體污染會對細胞培養有何影響？

支(zhi)原體(ti)污染幾(ji)乎可影(ying)響所有細胞(bao)之生長(chang)參數(shu)(shu)， 代謝及研(yan)究之任一數(shu)(shu)據。故進行實驗(yan)前，必須確認細胞(bao)為(wei)mycoplasma-free，實驗(yan)結果(guo)之數(shu)(shu)據方(fang)有意義。

23、偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？

直接滅菌(jun)后丟(diu)棄(qi)，以避(bi)免污(wu)染其它細胞株。

24、CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？

定(ding)期(至(zhi)少每兩周一次) 以無(wu)菌(jun)蒸餾水或無(wu)菌(jun)去離(li)子水更換之。

25、為何培養基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？

培(pei)養基(ji)(ji)保存(cun)于4 °C 冰箱中(zhong)， 培(pei)養基(ji)(ji)內之(zhi)CO2 會(hui)逐漸(jian)溢出(chu)，造(zao)成培(pei)養基(ji)(ji)越(yue)來越(yue)偏(pian)堿性(xing)。而培(pei)養基(ji)(ji)中(zhong)之(zhi)酸堿指示劑(通(tong)常為phenol red) 的(de)顏(yan)色也(ye)會(hui)隨堿性(xing)增加而更偏(pian)暗紅。培(pei)養基(ji)(ji)偏(pian)堿之(zhi)結果， 將造(zao)成細胞生長停滯或死亡(wang)。若培(pei)養基(ji)(ji)偏(pian)堿時(shi)， 可以通(tong)入無(wu)菌過濾之(zhi)CO2， 以調整pH 值。

26、各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？

不同(tong)廠牌的(de)(de)dish 或(huo)flask， 其所coating 的(de)(de)polymer 不同(tong)， 制(zhi)造程序亦不同(tong)， 雖對大部分細(xi)胞沒有太大之影響， 惟(wei)少數細(xi)胞則可能因使(shi)用廠牌不同(tong)之dish 或(huo)flask 而有顯著之生長差異。

27、購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？

研(yan)究(jiu)人員在冷凍細(xi)(xi)(xi)胞(bao)之培(pei)養時出現細(xi)(xi)(xi)胞(bao)數目太少， 大(da)都是因(yin)為(wei)離(li)心(xin)過(guo)程操(cao)作上的失(shi)(shi)誤， 造(zao)成細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的物理性損傷(shang)， 以及細(xi)(xi)(xi)胞(bao)流失(shi)(shi)。建議(yi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)解凍后不要立刻離(li)心(xin)， 應待細(xi)(xi)(xi)胞(bao)生長隔夜后再更換(huan)培(pei)養基即可。

28、購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

研究(jiu)人員在培養(yang)(yang)時出(chu)現存活率不(bu)(bu)佳(jia)， 常見(jian)原因可歸納為(wei)：培養(yang)(yang)基使用錯誤(wu)或培養(yang)(yang)基品質(zhi)不(bu)(bu)佳(jia)。血清使用錯誤(wu)或血清的(de)品質(zhi)不(bu)(bu)佳(jia)。解凍(dong)過(guo)程錯誤(wu)。冷凍(dong)細胞(bao)解凍(dong)后，加以洗(xi)滌細胞(bao)和離心。懸浮細胞(bao)誤(wu)認為(wei)死細胞(bao)。培養(yang)(yang)溫度使用錯誤(wu)。細胞(bao)置于–80 °C 太(tai)久(jiu)。

29、L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？

L-谷氨酰胺(an)在(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養時(shi)是重要的(de)(de)。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺(an)可作(zuo)為培(pei)養細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)能量(liang)來源、參(can)與(yu)蛋白(bai)質的(de)(de)合(he)成和(he)核(he)酸代(dai)謝(xie)。L-谷氨酰胺(an)在(zai)溶液中經過一段時(shi)間后會降解(jie)，但是確切的(de)(de)降解(jie)率一直(zhi)沒有zui終定論。L-谷氨酰胺(an)的(de)(de)降解(jie)導(dao)致(zhi)氨的(de)(de)形成，而氨對于一些細(xi)(xi)(xi)胞(bao)具(ju)有毒性。

30、GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？

GlutaMAX-I 二肽(tai)是一個L-谷氨(an)酰(xian)胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨(an)基用(yong)L-丙氨(an)酸來保護。一種肽(tai)酶(mei)逐(zhu)漸(jian)裂解(jie)二肽(tai)，釋放L-谷氨(an)酰(xian)胺供利(li)用(yong)。

GlutaMAX-I二肽非常穩定(ding)，即使在(zai)121磅(bang)滅菌(jun)20分鐘(zhong)，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解(jie)，如果(guo)在(zai)相(xiang)同(tong)條件(jian)下，L-谷氨(an)酰胺幾乎*降解(jie)。

31、什么培養基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養基(ji)中(zhong)用作PH值的(de)指示劑：中(zhong)性(xing)(xing)時為紅色(se)(se)，酸(suan)性(xing)(xing)時為黃(huang)色(se)(se)，堿性(xing)(xing)時為紫色(se)(se)。研究(jiu)表明，酚紅可以模擬固醇類激素(su)的(de)作用，（特別是(shi)雌激素(su)）。為避免(mian)固醇類反(fan)應，培養細胞，尤(you)其(qi)是(shi)哺乳類時，用(yong)不加(jia)酚(fen)(fen)紅的培(pei)養(yang)基(ji)。由(you)于酚(fen)(fen)紅干擾檢測(ce)，一(yi)些研究(jiu)人員在做流式細胞檢測(ce)時，不使用(yong)加(jia)有酚(fen)(fen)紅的培(pei)養(yang)基(ji)。

32、如何用臺盼蘭計數活細胞？

用無血清培(pei)養基把(ba)細(xi)(xi)胞(bao)懸液(ye)稀(xi)釋到200～2000個/毫(hao)升，在0.1毫(hao)升細(xi)(xi)胞(bao)懸液(ye)中加0.1毫(hao)升0.4％的臺盼蘭溶(rong)液(ye)。輕(qing)輕(qing)混勻，數(shu)分(fen)鐘后，用血球計(ji)數(shu)板計(ji)數(shu)細(xi)(xi)胞(bao)。活細(xi)(xi)胞(bao)排斥臺盼蘭，因而染(ran)成(cheng)藍色細(xi)(xi)胞(bao)是死細(xi)(xi)胞(bao)。

33、培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為(wei)細胞(bao)培養中的替代碳源，盡管細胞(bao)更傾向(xiang)于以葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)作為(wei)碳源，但是，如果沒有葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)的話，細胞(bao)也(ye)可以代謝丙酮酸鈉。

34、二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

二價離(li)(li)子的(de)確抑制胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶活性(xing)。EDTA用來螯合游離(li)(li)的(de)鎂(mei)離(li)(li)子和鈣(gai)離(li)(li)子，以(yi)便保持抑制胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶的(de)活性(xing)。建議胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶處理細(xi)胞(bao)前，用EDTA清洗細(xi)胞(bao)，以(yi)消除來自培養基中所有(you)的(de)二價離(li)(li)子。

35、室溫下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？

緩沖液PH值(zhi)隨(sui)溫度(du)變化(hua)而(er)變化(hua)。下表列出了50mM Tris-HC 溶(rong)液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值(zhi)。

50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值(zhi)

4°C  25°C   37°C

8.1  ;    8.5     7.2

8.2      7.6     7.3

8.3      7.7     7.4

8.4      7.8     7.5

8.5      7.9     7.6

8.6      8.0     7.7

8.7      8.1     7.8

8.8  ;    8.2     7.9

8.9      8.3     8.0

9.0      8.4     8.1

9.1      8.5     8.2

9.2      8.6     8.3

9.3      8.7     8.4

9.4      8.8   8.5

36、如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我(wo)們推(tui)薦使用脫落的方法，此(ci)技術破壞(huai)性zui小，生活力zui高。通過使用巴(ba)斯德吸液管，讓細(xi)胞上培養基流動。作為(wei)一種選擇你也(ye)可以輕輕拍打培養瓶。只有在必(bi)要的情況下，才使用胰酶消(xiao)化細(xi)胞。

37、胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：

（1）去除(chu)培養基。

（2）用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面(mian)）洗(xi)滌細胞，去除PBS。

（3）加入2ml 1x胰酶(mei)EDTA（恰好覆蓋細胞表(biao)面）。

（4）37 ℃孵育5到(dao)(dao)10分鐘。在(zai)儀器下(xia)檢測看到(dao)(dao)5分鐘后它們(men)正(zheng)在(zai)向上移(yi)動(dong)。

（5）向細(xi)胞中加入2ml 細(xi)胞培(pei)養液，移入錐形管(guan)，用2ml培(pei)養液洗瓶壁，移入同一(yi)錐形管(guan)中。（培(pei)養基中的FBS終(zhong)止了胰酶的活性。）

（6）離心(xin)（1100rpm）沉(chen)淀細胞。去除培養基。

（7）用新的培養基重新懸浮細胞。傳(chuan)代(dai)。

38、在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時，肝素的使用量是多少？

為了防止聚集的形(xing)成，使用肝素(su)濃度(du)為10單位/毫升(sheng)細胞懸液。

39、在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當細(xi)胞經過30次(ci)傳代后，應該(gai)返回凍存。無論什么時(shi)候計數時(shi)，都應該(gai)檢查細(xi)胞活力。如果(guo)超(chao)過95％的細(xi)胞保持(chi)有活力和(he)在大約30小時(shi)左右加倍(bei)(bei)，細(xi)胞仍然(ran)可(ke)以(yi)使用(yong)。如果(guo)活力和(he)加倍(bei)(bei)時(shi)間下降(jiang)，它們的感染力將不在是有效的。

40、貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基，在放置幾天后顏色變紫?

這主(zhu)要(yao)是由于在(zai)暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導(dao)致了pH值的上升。您可以在(zai)使用前松開瓶口，在(zai)CO2培(pei)養箱孵育培(pei)養基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證(zheng)氣體交換(huan)）。

41、細胞培養基偶然被凍，可否繼續使用？

如(ru)果(guo)培養(yang)基偶(ou)然被(bei)凍，您(nin)應該熔(rong)化培養(yang)基并觀(guan)察(cha)是否有沉(chen)淀(dian)產(chan)生。如果沒有沉(chen)淀(dian)產(chan)生，培養(yang)基可以(yi)正常使用，如果出(chu)現沉(chen)淀(dian)，只(zhi)能丟棄這些培養(yang)基。

42、無血清培養與有血清培養使用的抗生素量一樣嗎？

當(dang)在無(wu)血(xue)(xue)清(qing)培(pei)養基(ji)中(zhong)添加抗生(sheng)素時，降(jiang)低(di)至少在有血(xue)(xue)清(qing)培(pei)養基(ji)中(zhong)所使用(yong)濃(nong)度的50%。血(xue)(xue)清(qing)蛋白(bai)會結合和滅(mie)活一些(xie)抗生(sheng)素。在無(wu)血(xue)(xue)清(qing)培(pei)養條(tiao)件(jian)下，抗生(sheng)素不被滅(mie)活，可(ke)能(neng)對于(yu)細胞達到毒性(xing)水平。

43、培養基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？

一旦您(nin)在(zai)新鮮培養基中(zhong)添加(jia)了血清(qing)和(he)抗(kang)生素時，您(nin)應(ying)該在(zai)兩(liang)到三周(zhou)內使用它(ta)。因為一些(xie)抗(kang)生素和(he)血清(qing)中(zhong)的基本成分在(zai)解(jie)凍后(hou)就開始降解(jie)。

44、培養基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎？

大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數更多都會(hui)在包含蛋(dan)白的溶液引起一定水平的降解和沉淀(dian)，將會(hui)影響它的性能。

45、為什么要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

胰(yi)蛋(dan)白酶在4℃就(jiu)可能開始降解，如(ru)果在室(shi)溫下放置超(chao)過(guo)30分鐘，就(jiu)會變得不穩定(ding)。

46、保存血清的方法?

我(wo)們建議(yi)血清(qing)(qing)應(ying)保存在-5℃至(zhi)-2O℃。若(ruo)存放于4℃時(shi)，請勿超過一(yi)(yi)個月。若(ruo)一(yi)(yi)次(ci)無法(fa)用完(wan)一(yi)(yi)瓶，建議(yi)無菌分裝(zhuang)血清(qing)(qing)至(zhi)恰(qia)當的滅菌容(rong)器內(nei)，再(zai)放回冷凍。

47、如何解凍血清才不會使產品質量受損?

將血清(qing)從(cong)冷凍箱(xiang)取(qu)出后，先置于2～8℃冰箱(xiang)使之融(rong)(rong)解，然后在室溫下(xia)使之全融(rong)(rong)。但必(bi)須注意(yi)的是，融(rong)(rong)解過程中必(bi)須規則地搖晃均勻(yun)。

48、血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理?

血(xue)(xue)(xue)清中(zhong)(zhong)沉(chen)淀物(wu)的(de)出現有許多(duo)種原(yuan)因，但zui普遍的(de)原(yuan)因是由于(yu)血(xue)(xue)(xue)清中(zhong)(zhong)脂蛋白(bai)的(de)變性所造(zao)成，而血(xue)(xue)(xue)纖維蛋白(bai)(形成凝(ning)血(xue)(xue)(xue)的(de)蛋白(bai)之一(yi))在血(xue)(xue)(xue)清解(jie)凍后，也會存在于(yu)血(xue)(xue)(xue)清中(zhong)(zhong)，亦是造(zao)成沉(chen)淀物(wu)的(de)原(yuan)因之一(yi)。但這些(xie)絮(xu)狀(zhuang)沉(chen)淀物(wu)，并不影響血(xue)(xue)(xue)清本身的(de)質量。

若(ruo)欲去(qu)除這些絮狀沉淀物(wu)，可以將(jiang)血清分裝至無菌(jun)離心管內，以400g稍微離心,上清液即可接(jie)著加入培養基內一起過(guo)濾。不使用(yong)過(guo)濾的方法去(qu)除這些絮狀沉淀物(wu)，因為它可能會(hui)阻(zu)塞過(guo)濾膜。

49、為什么要熱滅活血清?

加熱可(ke)以滅活補體系統(tong)。激(ji)活的補體參與溶(rong)解細(xi)(xi)胞(bao)(bao)事件(jian)，刺激(ji)平(ping)滑肌(ji)收縮，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)血小板釋放組胺(an)，激(ji)活淋巴(ba)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)。在免疫學研究，培養(yang)ES細(xi)(xi)胞(bao)(bao)、平(ping)滑肌(ji)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)時，推(tui)薦使(shi)用(yong)熱滅活血清。

50、有必要做熱滅活嗎?

實驗顯(xian)示(shi)，經過正確處理的熱滅活血清(qing)(qing)，對大多數的細胞而言(yan)是不需要(yao)的。經此處理過的血清(qing)(qing)對的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)長只有微小的(de)(de)(de)促進，或*沒有任(ren)何(he)作用，甚至通(tong)常因為(wei)高(gao)溫處理(li)影響了血(xue)清的(de)(de)(de)質量，而(er)造成(cheng)細(xi)胞生(sheng)(sheng)長速率的(de)(de)(de)降(jiang)低。而(er)經過熱(re)處理(li)的(de)(de)(de)血(xue)清，沉(chen)淀物(wu)的(de)(de)(de)形成(cheng)會顯著的(de)(de)(de)增(zeng)(zeng)多，這些沉(chen)淀物(wu)在倒置顯微鏡下(xia)觀察，像是“小黑點"，常常會讓研(yan)究(jiu)者(zhe)誤以為(wei)是血(xue)清遭受污染，而(er)把血(xue)清放在37℃環境中(zhong)，又會使此沉(chen)淀物(wu)更(geng)增(zeng)(zeng)多，使研(yan)究(jiu)者(zhe)誤認(ren)為(wei)是微生(sheng)(sheng)物(wu)的(de)(de)(de)分裂擴增(zeng)(zeng)。

若非必(bi)須，可以不需要做熱處理這(zhe)一步。不但節省(sheng)時(shi)間(jian)，更確保(bao)血清的質量!

51、為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀?

有些胎牛血清(qing)產品沒有預老(lao)化，儲(chu)存(cun)在2－8℃時，血清(qing)中的(de)(de)各種(zhong)蛋(dan)白(bai)和(he)脂蛋(dan)白(bai)（如冷凝(ning)集素、纖維蛋(dan)白(bai)原、玻(bo)粘連蛋(dan)白(bai)等(deng)）可能聚集而形成(cheng)沉淀(dian)或可見的(de)(de)混濁(zhuo)。這(zhe)應該不(bu)會影(ying)響血清(qing)的(de)(de)質量。推薦在－20℃儲(chu)存(cun)胎牛血清(qing)，避免(mian)反復凍(dong)融。

52、如何避免沉淀物的產生?

我(wo)們建議您在使用血清(qing)的(de)時候(hou)，注意下列的(de)操作:

(1)解(jie)凍(dong)血清時，請(qing)按照所建(jian)議的逐步解(jie)凍(dong)法(-20℃至4℃至室(shi)溫)，若血清解(jie)凍(dong)時改變的溫度太大(如(ru)-20℃至37℃)，非常容易(yi)產(chan)生沉淀(dian)物(wu)。

(2)解凍血清時(shi)，請(qing)隨時(shi)將之搖(yao)晃(huang)均勻，使(shi)溫度及(ji)成分(fen)均一，減少(shao)沉淀的發生。

(3)請(qing)勿將(jiang)血(xue)(xue)清(qing)(qing)置于37℃太(tai)久。若在37℃放置太(tai)久，血(xue)(xue)清(qing)(qing)會(hui)變(bian)得混濁，同時血(xue)(xue)清(qing)(qing)中(zhong)許(xu)多較不穩定的成分也會(hui)因(yin)此(ci)受到損害，而影響血(xue)(xue)清(qing)(qing)的質量。

(4)血(xue)清(qing)的(de)熱滅活(huo)非常容易造(zao)成沉淀(dian)物的(de)增多，若非必要(yao)，可以無須做此步驟。

(5)若必(bi)須做血清的熱滅活，請(qing)遵守(shou)56℃，30分鐘的原(yuan)則(ze)，并且隨時搖晃均勻。溫度過(guo)(guo)高，時間過(guo)(guo)久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多(duo)。