K1人(ren)乳頭狀甲狀腺癌(ai)細胞株培養說(shuo)明(ming)書(shu)

細(xi)胞特性

1）來源：甲狀腺(xian)癌

2）形態：上(shang)皮細胞(bao)樣

3）含量：>1x10⁶ 個/mL

4）污染：支(zhi)原體、細(xi)菌、酵母和(he)真菌檢測為陰性(xing)

5）規(gui)格(ge)：T75瓶或者1mL凍存管包裝

運輸(shu)和保存：使用含有胎牛血清的2ml凍存管發送存活細(xi)胞。收到細(xi)胞后，可在1000RPM，常溫條件(jian)下，離心5min后(hou)，于潔(jie)凈操作臺棄(qi)去上(shang)清，加入推薦使用的培養基后(hou)轉移至10cm培養皿或者T75培(pei)養(yang)瓶中(zhong)培(pei)養(yang)，傳代達到細胞(bao)生長狀態良好時，再進行凍存。具體操作見細胞(bao)培(pei)養(yang)步驟。

細(xi)胞培養步驟(zou)

一．培(pei)養(yang)基及(ji)培(pei)養(yang)凍存條件準備：

1.準(zhun)備DMEM/F12培養基(DMEM/F12:GIBCO,貨(huo)號10565-018)，90%；胎牛血(xue)清，10%。

2.培(pei)養條件： 氣相(xiang)：空氣，95%；二氧(yang)化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為(wei)70%-80%。

3.凍存液：90%*培養(yang)基，10%DMSO，現用現配。液氮儲存。

細胞處(chu)理：

1）復蘇細(xi)胞：將含有1mL細胞懸液的(de)凍存管在37℃水浴中迅(xun)速搖晃解凍(dong)，加入4mL培養基混(hun)合均勻。在1000RPM條件下離(li)心(xin)4分(fen)鐘，棄去上清液，補加(jia)1-2mL培(pei)(pei)(pei)養基后吹(chui)勻。然后將所(suo)有細胞懸液(ye)(ye)加入培(pei)(pei)(pei)養瓶中培(pei)(pei)(pei)養隔夜（或將細胞懸液(ye)(ye)加入10cm皿中，加入約8ml培(pei)養基(ji)，培(pei)養隔(ge)夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞(bao)傳代：如果細胞密度達(da)80%-90%，即可進行(xing)傳代培養(yang)。

1. 棄(qi)去培(pei)養(yang)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xi)胞1-2次。

2. 加2ml消(xiao)化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶(ping)中，置于37℃培養箱中消化(hua)1-2分(fen)鐘，然后在顯微鏡(jing)下(xia)觀察細胞消化(hua)情況(kuang)，若細胞大部分(fen)變圓并脫落，迅速拿回(hui)操(cao)作(zuo)臺，輕敲幾下(xia)培養瓶后加(jia)少量(liang)培養基終止消化(hua)。

3. 按6-8ml/瓶補加(jia)培養基，輕輕打(da)勻后吸出，在(zai)1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2到(dao)1：5的比例(li)分(fen)到新的含8ml培養基的新(xin)皿(min)中或者瓶中。

3）細胞凍存：待(dai)細(xi)胞(bao)生長狀態良好(hao)時(shi)，可進行(xing)細(xi)胞(bao)凍存。貼壁細(xi)胞(bao)凍存時(shi)，棄去培養基(ji)后加入(ru)少量胰(yi)酶(mei)，細(xi)胞(bao)變圓脫(tuo)落后，加入(ru)約(yue)1ml含血清的培養基(ji)后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進行凍(dong)存。

注意事項(xiang)：

1. 收(shou)到細(xi)胞后，若發(fa)現干冰已揮(hui)發(fa)干凈、凍存(cun)管瓶(ping)蓋脫落(luo)、破損及細(xi)胞有(you)污染，請(qing)立即與我們。

2. 所有(you)(you)動物細(xi)胞均(jun)視為有(you)(you)潛在(zai)的生物危害(hai)性，必須在(zai)二級(ji)生物安(an)全臺內操作，并請注意(yi)防(fang)護，所有(you)(you)廢液及(ji)接觸過此細(xi)胞的器皿需要滅菌后方能(neng)丟棄。