細胞活化(hua)和復蘇(su)

1. 收到包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養， 或立即冷凍保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。

細胞復(fu)蘇的(de)原則－快速融化：

必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

具體(ti)操作

一(yi). 實(shi)驗前準備：

1.將水(shui)浴鍋預(yu)熱至37℃

2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

3.在超凈工作臺中按次序擺放(fang)好消過毒的離心管、吸管、培養瓶(ping)等等。

二．取出凍存(cun)管：

1.根據凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

2.從(cong)液氮罐中(zhong)取出細胞盒，取出所需的(de)細胞，同時核對管(guan)外的(de)編號。

三．迅速解凍(dong)：

1.迅(xun)速將凍存管(guan)投入到已經預熱的(de)(de)水浴鍋(guo)中迅(xun)速解(jie)凍，并(bing)要不(bu)斷的(de)(de)搖動，使(shi)管(guan)中的(de)(de)液體(ti)迅(xun)速融化。

2.約1-2min后凍(dong)存(cun)管內液體*溶解，取出(chu)用酒精棉球(qiu)擦拭凍(dong)存(cun)管的外壁(bi)，再拿入(ru)超凈臺(tai)內。

四.平衡離(li)心：用架(jia)盤天平平衡后，放(fang)入離(li)心機中3000r/min 離(li)心3min

五(wu).制(zhi)備細胞懸液：

1.吸棄上清液。

2.向離心管內加(jia)入10ml培養液(ye)(ye)，吹打制成(cheng)細胞懸液(ye)(ye)。

六.細胞計數：細胞濃度以5×105/ml為宜。

七.培養(yang)(yang)細(xi)胞(bao)將復合細(xi)胞(bao)計數要(yao)求的細(xi)胞(bao)懸液(ye)分裝入培養(yang)(yang)瓶(ping)內，將培養(yang)(yang)瓶(ping)放入37℃和(he)5％CO2的培養(yang)(yang)箱內2-4小(xiao)(xiao)時(shi)(shi)（或(huo)者24-48小(xiao)(xiao)時(shi)(shi)）后換液(ye)繼續培養(yang)(yang)培養(yang)(yang)，換液(ye)的時(shi)(shi)間(jian)由細(xi)胞(bao)情(qing)況而定。

初學者易(yi)犯錯誤：

1水浴鍋未預熱或者(zhe)未預熱到(dao)37℃。

2.水浴(yu)鍋內凍存管太多，導致傳(chuan)熱不佳，使融化時(shi)間(jian)延長。

3.離心(xin)前忘記平衡，導(dao)致離心(xin)機損壞和細胞丟失。

4.一次復(fu)蘇細(xi)胞過多，忘記更換吸(xi)頭和(he)吸(xi)管，導致細(xi)胞交叉(cha)污染。

（另：冷凍細胞(bao)解凍程序(xu)）

2.1. 依據數據單之基礎培養基種類、血清種類和其它之成份和比例， 制備培養基。絕大多數之細胞均無法立即適應不同之基礎培養基或不同之血清種類， 若因實驗需要， 必須有所不同時， 務必以緩慢比例漸次改變培養基組成， 確定細胞適應后， 方進行所需之實驗。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛(niu)血(xue)清), CS (calf serum, 小牛(niu)血(xue)清)和(he)HS (horse serum, 馬血(xue)清)，對(dui)細胞(bao)而言(yan)差異極大(da)，請務必(bi)依據細胞(bao)株(zhu)資(zi)料單(dan)之(zhi)(zhi)血(xue)清種(zhong)類培養(yang)之(zhi)(zhi)。

2.3. 將(jiang)培養基置(zhi)于 37 °C水(shui)槽中回溫，回溫后(hou)噴以70 % 酒精(jing)并擦拭之， 移入無菌操作臺(tai)內。取(qu)出冷凍(dong)管(guan)， 立即放入37 °C 水(shui)槽中快速解凍(dong)， 水(shui)面高(gao)度不可(ke)接近(jin)或高(gao)過冷凍(dong)管(guan)之蓋沿(yan)， 否(fou)則易發生(sheng)污(wu)染。輕搖冷凍(dong)管(guan)使其(qi)在1 分鐘內全部融化后(hou)， 以70 % ethanol 擦拭冷凍(dong)管(guan)外部， 移入無菌操作臺(tai)內。

2.4. 依(yi)據細胞種類和濃度(du)，于(yu)無菌操作臺內取 10 ml培(pei)養(yang)基(ji)加至 T25或 T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩(huan)緩(huan)加入(ru)T25 或T75 flask 內之培(pei)養(yang)基(ji)， 混 合均(jun)勻，放入(ru)37 °C，5 % CO2 培(pei)養(yang)箱培(pei)養(yang)。

2.5. 對(dui)絕(jue)大多數細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)而言，1 % 以下(xia)之冷凍(dong)保護劑DMSO，不(bu)會對(dui)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)之貼(tie)附或活(huo)化有不(bu)良影響，不(bu)需立刻由(you)解凍(dong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中去除(chu)，待(dai)第(di)二(er)天確定(ding)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)生長或貼(tie)附良好后(hou)(hou)再(zai)去除(chu)即可。唯(wei)對(dui)極少數因對(dui)DMSO 敏(min)感或會造成細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)分(fen)化之細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，需立即去除(chu)DMSO 者， 則可將解凍(dong)后(hou)(hou)之細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)懸浮液放入(ru)(ru)5 - 10 ml 培(pei)(pei)養基中,離心(xin)300 xg (約1000 rpm)，5 分(fen)鐘，小心(xin)移(yi)去上清液，加入(ru)(ru)適(shi)量新(xin)鮮培(pei)(pei)養基，將細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)均勻混合后(hou)(hou)， 轉移(yi)至培(pei)(pei)養瓶中， 再(zai)放入(ru)(ru)37 °C， 5 % CO2 培(pei)(pei)養箱培(pei)(pei)養。收(shou)到T25 flask 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)時， 處理方式為︰

1. 于寄送過程中，為避免起泡造成脫落死亡，T25 flask 均加滿培養基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。

2. 將(jiang)(jiang)原封之T25 flask 靜置(zhi)于(yu)37 °C， 5 % CO2 培(pei)養箱中(zhong)，使(shi)細(xi)胞(bao)回溫至37 °C， 并讓運送(song)過程中(zhong)少數脫落(luo)的細(xi)胞(bao)可(ke)再附著生(sheng)長(chang)(chang)。隔天后，于(yu)無菌操作箱內取出(chu)flask內之培(pei)養基，(取出(chu)之培(pei)養基可(ke)以再使(shi)用)，僅(jin)留約5-10ml 培(pei)養基于(yu)flask 內，依 一般(ban)培(pei)養方式再將(jiang)(jiang)細(xi)胞(bao)置(zhi)入培(pei)養箱中(zhong)或細(xi)胞(bao)已長(chang)(chang)滿盤， 則將(jiang)(jiang)細(xi)胞(bao)做(zuo)傳代培(pei)養。