人卵巢癌(ai)細胞系 活化與復蘇

1. 收到(dao)包裹時， 請(qing)檢查(cha)細(xi)胞(bao)株冷凍管是否有(you)解凍情(qing)形， 若有(you)請(qing)立即通知。細(xi)胞(bao)株請(qing)盡速(su)開始培(pei)養， 或立即冷凍保(bao)存(cun)(置于–70 °C， 隔夜后， 移(yi)到(dao)liq N2)。

細胞復(fu)蘇的(de)原則－快速融化：

必須將凍(dong)存在-196℃液氮中(zhong)的細胞(bao)快速融化(hua)至37℃，使細胞(bao)外凍(dong)存時的冰晶(jing)(jing)迅速融化(hua)，避免冰晶(jing)(jing)緩慢(man)融化(hua)時進(jin)入細胞(bao)形成再結晶(jing)(jing)，對細胞(bao)造成損害。

具體操作

一. 實驗前準備(bei)：

1.將水浴鍋預熱(re)至37℃

2.用75％酒(jiu)精(jing)擦拭(shi)紫外線照射30min的(de)超(chao)凈工(gong)作臺臺面。

3.在超凈工作(zuo)臺中按次序擺放好消過毒的離(li)心管、吸管、培養瓶等等。

二．取出(chu)凍存管(guan)：

1.根據細(xi)(xi)胞凍(dong)存記錄按標簽找到所需(xu)細(xi)(xi)胞的編號。

2.從液氮罐中(zhong)取出(chu)細胞盒，取出(chu)所需的細胞，同(tong)時核(he)對管(guan)外的編號。

三．迅速(su)解(jie)凍：

1.迅速將(jiang)凍存管投入到已經預(yu)熱的水(shui)浴鍋中迅速解(jie)凍，并要(yao)不(bu)斷(duan)的搖動，使管中的液體迅速融(rong)化。

2.約1-2min后凍存(cun)管(guan)內液體*溶解(jie)，取出用酒精(jing)棉球擦拭凍存(cun)管(guan)的外壁，再(zai)拿入(ru)超凈臺內。

四.平衡離心：用(yong)架盤天平平衡后，放入離心機中(zhong)3000r/min 離心3min

五(wu).制備細胞懸液：

1.吸棄上清液。

2.向(xiang)離心(xin)管內(nei)加入10ml培養液(ye)，吹打制成細胞懸液(ye)。

六(liu).細胞計數：細胞濃度以(yi)5×105/ml為宜(yi)。

七(qi).培(pei)養(yang)(yang)(yang)細(xi)胞(bao)將(jiang)復合細(xi)胞(bao)計數要求的細(xi)胞(bao)懸液分裝入培(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶內，將(jiang)培(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶放(fang)入37℃和5％CO2的培(pei)養(yang)(yang)(yang)箱內2-4小時（或者24-48小時）后(hou)換液繼(ji)續培(pei)養(yang)(yang)(yang)培(pei)養(yang)(yang)(yang)，換液的時間由細(xi)胞(bao)情(qing)況而(er)定。

初(chu)學者易犯(fan)錯誤：

1.水(shui)浴鍋(guo)未(wei)預(yu)熱或者(zhe)未(wei)預(yu)熱到37℃。

2.水浴鍋(guo)內(nei)凍存(cun)管太多，導致(zhi)傳熱不佳，使融化時間延長。

3.離心前忘記平衡(heng)，導致(zhi)離心機損(sun)壞和細胞丟失(shi)。

4.一次復(fu)蘇(su)細胞過多，忘記更換(huan)吸頭(tou)和吸管(guan)，導致細胞交叉污染。

（另：冷凍細胞解凍程(cheng)序）

2.1. 依據人卵巢癌細胞系數據單之基礎培養基種類、血清種類和其它之成份和比例， 制備培養基。絕大多數之細胞均無法立即適應不同之基礎培養基或不同之血清種類， 若因實驗需要， 必須有所不同時， 務必以緩慢比例漸次改變培養基組成， 確定細胞適應后， 方進行所需之實驗。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清(qing)), CS (calf serum, 小牛血清(qing))和HS (horse serum, 馬血清(qing))，對細胞而言差異極大(da)，請(qing)務必依據(ju)細胞株資料單之血清(qing)種類培養之。

2.3. 將培(pei)養基置于(yu) 37 °C水槽中回(hui)溫，回(hui)溫后(hou)(hou)噴以70 % 酒精并擦拭(shi)之， 移入無(wu)菌操作臺(tai)內(nei)。取出冷(leng)(leng)凍管， 立(li)即放入37 °C 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷(leng)(leng)凍管之蓋沿， 否則易發生污染。輕搖冷(leng)(leng)凍管使其在1 分鐘內(nei)全部(bu)(bu)融(rong)化后(hou)(hou)， 以70 % ethanol 擦拭(shi)冷(leng)(leng)凍管外(wai)部(bu)(bu)， 移入無(wu)菌操作臺(tai)內(nei)。

2.4. 依據細胞(bao)種類和濃度，于(yu)無菌操作(zuo)臺內(nei)取 10 ml培養(yang)(yang)(yang)基加至 T25或 T75 flask中。取出(chu)已解(jie)凍之細胞(bao)懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nei)之培養(yang)(yang)(yang)基， 混 合均(jun)勻，放入37 °C，5 % CO2 培養(yang)(yang)(yang)箱培養(yang)(yang)(yang)。

2.5. 對(dui)絕大多(duo)數細(xi)(xi)(xi)胞(bao)而(er)言(yan)，1 % 以下之(zhi)冷凍保護劑DMSO，不會對(dui)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)之(zhi)貼附或活化有不良影響，不需(xu)立刻由解(jie)(jie)凍細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)去除(chu)，待第二(er)天確定(ding)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)生長或貼附良好后再去除(chu)即可。唯對(dui)極少(shao)數因對(dui)DMSO 敏感或會造成細(xi)(xi)(xi)胞(bao)分化之(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，需(xu)立即去除(chu)DMSO 者， 則可將解(jie)(jie)凍后之(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)懸浮(fu)液放入5 - 10 ml 培養基(ji)中(zhong),離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘(zhong)，小心移去上清液，加入適量新鮮培養基(ji)，將細(xi)(xi)(xi)胞(bao)均勻混合后， 轉移至培養瓶中(zhong)， 再放入37 °C， 5 % CO2 培養箱培養。收到T25 flask 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)時， 處理方式(shi)為︰

1. 于(yu)寄(ji)送過程(cheng)中(zhong)，為避免起泡造成細(xi)(xi)胞脫(tuo)落死亡，T25 flask 均(jun)加滿培養基(ji)。請(qing)檢查(cha)flask 外觀(guan)，并于(yu)顯(xian)微鏡下觀(guan)察(cha)細(xi)(xi)胞生長狀況和有(you)無污(wu)染(ran)現象(xiang)，若有(you)任何問題， 不要打開(kai)蓋子，請(qing)立即通知細(xi)(xi)胞實驗室。

2. 將(jiang)原(yuan)封之(zhi)T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養(yang)(yang)箱中，使(shi)細(xi)胞回溫至37 °C， 并讓(rang)運送(song)過程中少數(shu)脫落的細(xi)胞可再(zai)附著(zhu)生長。隔天后，于無菌(jun)操(cao)作(zuo)箱內(nei)取(qu)出flask內(nei)之(zhi)培養(yang)(yang)基(ji)，(取(qu)出之(zhi)培養(yang)(yang)基(ji)可以再(zai)使(shi)用)，僅留(liu)約(yue)5-10ml 培養(yang)(yang)基(ji)于flask 內(nei)，依 一(yi)般培養(yang)(yang)方(fang)式再(zai)將(jiang)細(xi)胞置入培養(yang)(yang)箱中或細(xi)胞已長滿盤， 則將(jiang)細(xi)胞做傳代(dai)培養(yang)(yang)。

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