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TUNEL細胞凋亡檢測 (TUNEL Apoptosis Assay)是一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于待檢測的細胞或組織樣品,經過生物素標記和后續的DAB顯色等步驟,即可在普通光學顯微鏡下觀察到凋亡細胞。
細胞在發生凋亡時,會激活一些DNA內切酶,這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測,可以發現180-200bp的DNA ladder。
基因組DNA斷裂時,暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標記的dUTP(Biotin-dUTP),隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結合,zui后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞。
技術步驟
1. 材料與試劑 (以Promega試劑盒為例),包括:
(1)生物素標記的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標記的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/µL
(2)TdT酶(25U/μL)
(3)反應緩沖液
(4)洗滌緩沖液
(5)異硫氰酸熒光素(FITC)標記的親合素或鏈霉親合素(2.5µg/mL)或抗地高辛抗體(1︰30)
(6)PI染液(含PI 5µg/mL及無DNA酶活性的RNA酶0.1%)
(7)PBS緩沖液
(8)塑料蓋玻片
2. 樣品
(1)懸浮生長培養細胞的甩片或涂片
(2)貼壁生長的培養細胞
(3)冰凍切片
(4)常規石蠟切片
3. 操作方法
(1)固定:培養細胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后,用80%酒精再固定2h(-20℃)。常規4%中性福爾馬林固定、石蠟包埋之切片進行脫蠟、水化。
(2)洗滌:玻片浸入PBS緩沖液,搖床上洗滌5min,三次。
(3)反應:洗滌后的玻片用吸水紙吸干細胞或組織周圍水分,按50μl/cm2滴加反應液(每50μL反應液含TdT酶0.5μL,標記的-dUTP 1μL),使反應液均勻地覆蓋于所有細胞或組織切片上,蓋上塑料蓋玻片,置濕盒中,37℃孵育1h。
(4)終止反應:去掉塑料蓋玻片,將玻片置盛有洗滌緩沖液的染色缸內,洗滌兩次,每次5min。
(5)FITC標記:洗滌后的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周圍水分,按50μl/cm2滴加FITC反應液(含FITC 2.5μg/mL),室溫下避光孵育10min。
(6)洗滌:將玻片置于洗滌緩沖液內,洗兩次,每次5min。
(7)PI復染:將玻片置于盛有PI染液的染色缸內,室溫下避光染色30min。
(8)封片:用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上,亦可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣,置暗盒中,盡早鏡檢觀察。
4. 結果判定:用熒光顯微鏡觀察,選用藍色激發光(波長488nm),所有的細胞核均被PI著色,顯示出紅色熒光,而凋亡細胞被特異地標記上FITC,顯示出黃綠色熒光。
應用領域
細胞凋亡(apoptosis)的分析方法,細胞凋亡有一項重要的特征為細胞內的DNA會碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探測DNA片段的產生。
服務周期
交貨時間: 15~20天
客戶須知(對材料的要求、注意事項)
結果提供: 正常和陽性對照玻片及其1張數碼照片,剩余石蠟塊,檢測報告;
樣本要求:取材保持組織新鮮(組織塊以小于2cm×1.5cm×0.3cm為宜),立即放入固定液(固定液用10%福爾馬林液或4%多聚甲醛緩沖液,體積為組織塊的10倍以上)中,避免干燥;對于有血跡的樣本,可用PBS液或生理鹽水沖洗后直接放入固定液中;經固定后的樣本必須在48小時內處理。
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