在(zai)正(zheng)常細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)，磷(lin)(lin)脂(zhi)酰(xian)絲氨(an)(an)酸(suan)(suan)只分布在(zai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜脂(zhi)質雙(shuang)層的(de)(de)內側，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)發生凋亡(wang)早期(qi)，膜磷(lin)(lin)脂(zhi)酰(xian)絲氨(an)(an)酸(suan)(suan)（PS）由脂(zhi)膜內側翻向(xiang)外側。Annexin V是(shi)一種磷(lin)(lin)脂(zhi)結(jie)合蛋(dan)白，與(yu)磷(lin)(lin)脂(zhi)酰(xian)絲氨(an)(an)酸(suan)(suan)有高度親和力(li)，故可通過(guo)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)外側暴露的(de)(de)磷(lin)(lin)脂(zhi)酰(xian)絲氨(an)(an)酸(suan)(suan)與(yu)凋亡(wang)早期(qi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)胞(bao)(bao)(bao)膜結(jie)合。因此(ci)(ci)Annexin V被作為檢(jian)測細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)早期(qi)凋亡(wang)的(de)(de)靈敏(min)指(zhi)標之一。在(zai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)發生凋亡(wang)時，膜磷(lin)(lin)脂(zhi)酰(xian)絲氨(an)(an)酸(suan)(suan)外翻的(de)(de)發生早于細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核的(de)(de)變化(hua)，而(er)此(ci)(ci)時Propidium Iodide（PI）不能通過(guo)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜。

細(xi)(xi)胞(bao)(bao)壞死(si)時，雖然也會發(fa)生磷脂酰絲氨(an)酸(suan)(suan)外翻，但此時細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜的(de)通透性明顯增(zeng)加(jia)，PI等核酸(suan)(suan)染料進入細(xi)(xi)胞(bao)(bao)與細(xi)(xi)胞(bao)(bao)核中的(de)核酸(suan)(suan)結(jie)合，發(fa)出紅色(se)熒(ying)光。所(suo)以(yi)Annexin V-FITC(綠色(se)熒(ying)光)常(chang)與鑒定細(xi)(xi)胞(bao)(bao)死(si)活的(de)核酸(suan)(suan)染料（如PI）合并使用(yong)，來區分凋亡(wang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)與死(si)亡(wang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)。

技術(shu)原理(li)及(ji)步驟

1. 離心收集細胞，微量離心機轉速1000 rpm，離心時間5 min，棄培養基。

2. 用冷PBS洗滌細胞兩次(ci)。

3. 用400 μL1× Binding Buffer懸(xuan)浮細胞，濃度大約為1×106 cells/mL。

4. 在細胞懸浮液中加入5 μlLAnnexin V-FITC，輕(qing)輕(qing)混勻后于2~8°C避光條件下孵(fu)育15min。

5. 加入(ru)10 μL PI后輕輕混勻于2~8°C避光條件下孵育5 min。

6. 在1小時(shi)內用流(liu)式細(xi)胞儀(yi)或熒光顯微鏡(jing)檢測。

應用(yong)實例(li)

應用領域

細胞的早期(qi)凋亡及區分凋亡與壞死(si)細胞

服務周(zhou)期

我公司在正(zheng)式(shi)接受實驗委托2個星(xing)期(qi)左右完成實驗并(bing)提供實驗報告。

客戶須(xu)知（對材料的(de)要求(qiu)、注意(yi)事項）

需提(ti)供細胞類型，處理條件。

慧穎(ying)生物(wu)專業(ye)血(xue)(xue)清10年，我(wo)們不生產血(xue)(xue)清，我(wo)們只(zhi)是高(gao)品質動(dong)物(wu)血(xue)(xue)清的搬運(yun)工(gong)

血(xue)清是一(yi)種成分復雜(za)的(de)混合物，不同批次血(xue)清對(dui)細(xi)胞(bao)生(sheng)長的(de)促進(jin)作用(yong)不同。大規模細(xi)胞(bao)培養中由(you)血(xue)清引起的(de)細(xi)胞(bao)生(sheng)長狀態不佳及病毒滴度的(de)影(ying)響表現(xian)在以下(xia)幾(ji)個(ge)方(fang)面：

1、細(xi)胞生長(chang)速度緩慢，長(chang)滿(man)單層(ceng)(ceng)時間長(chang)；從(cong)同(tong)(tong)一細(xi)胞瓶中分出兩瓶細(xi)胞，用同(tong)(tong)一種培養液，分別加(jia)入10％的對(dui)(dui)照(zhao)血(xue)清(qing)(qing)和待(dai)檢(jian)血(xue)清(qing)(qing)，在相同(tong)(tong)條(tiao)件下(xia)培養72小時，會出現(xian)對(dui)(dui)照(zhao)血(xue)清(qing)(qing)長(chang)滿(man)單層(ceng)(ceng)，而(er)待(dai)檢(jian)血(xue)清(qing)(qing)大約(yue)只有60～70％，這種血(xue)清(qing)(qing)就不(bu)適合用來(lai)大規模培養細(xi)胞。

2、細(xi)胞(bao)傳(chuan)代(dai)后形(xing)態(tai)不正常(chang)，細(xi)胞(bao)狀(zhuang)態(tai)發生(sheng)變(bian)化 ；由于血清(qing)的質量問題，使原本狀(zhuang)態(tai)正常(chang)的細(xi)胞(bao)經(jing)傳(chuan)代(dai)后形(xing)態(tai)會(hui)變(bian)差；比如：細(xi)胞(bao)瓶(ping)里(li)會(hui)出現一些(xie)蠕動的小黑點（并非污染），或者細(xi)胞(bao)表面形(xing)成一層油狀(zhuang)覆蓋物；細(xi)胞(bao)的輪廓(kuo)變(bian)得(de)模糊，細(xi)胞(bao)之間的間隙被血清(qing)中的蛋白(bai)顆粒填充，從而影響細(xi)胞(bao)向四周擴展生(sheng)長(chang)。

3、細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)傳幾代(dai)(dai)后就(jiu)出現(xian)脫壁現(xian)象(xiang)(xiang)，不能(neng)連續(xu)傳代(dai)(dai) ；質量較差(cha)的(de)血清缺乏某(mou)種(zhong)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)貼(tie)壁因子，會使細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在傳代(dai)(dai)過程中逐漸喪失貼(tie)壁的(de)能(neng)力。細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)會從正常的(de)貼(tie)壁狀態(tai)，邊緣開始萎縮(suo)，上翹(qiao)。觀察(cha)到的(de)現(xian)象(xiang)(xiang)就(jiu)是細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)表(biao)面不光(guang)滑，晃動細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)瓶會看到細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)表(biao)面有絮狀物隨(sui)(sui)培養(yang)液波動。隨(sui)(sui)著傳代(dai)(dai)次數增加，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)萎縮(suo)的(de)情況越來越嚴重(zhong)，直到zui終(zhong)*脫壁而死亡。

4、細(xi)胞長的(de)(de)(de)很(hen)好，致密的(de)(de)(de)單層，狀(zhuang)態(tai)也(ye)很(hen)正常，但是接(jie)(jie)毒(du)后細(xi)胞基本不發(fa)生(sheng)病(bing)變，做(zuo)滴(di)度檢測幾(ji)乎測不出(chu)抗(kang)(kang)原滴(di)度。這種情(qing)況也(ye)許(xu)是因為血清中含有(you)(you)與接(jie)(jie)種的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)有(you)(you)同源的(de)(de)(de)特異性抗(kang)(kang)體(ti)。比如(ru)(ru)血清中經常會(hui)存(cun)在乙腦(nao)抗(kang)(kang)體(ti)，牛腹瀉病(bing)毒(du)抗(kang)(kang)體(ti)等(deng)，如(ru)(ru)果存(cun)在這些抗(kang)(kang)體(ti)，就(jiu)會(hui)把接(jie)(jie)進去的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)給(gei)(gei)中和掉。如(ru)(ru)果抗(kang)(kang)體(ti)滴(di)度很(hen)高，病(bing)毒(du)會(hui)被(bei)抗(kang)(kang)體(ti)*中和，就(jiu)沒有(you)(you)病(bing)毒(du)顆(ke)粒在細(xi)胞中增殖，所以會(hui)檢測不到病(bing)毒(du)滴(di)度。這種情(qing)況給(gei)(gei)疫苗(miao)企業造成的(de)(de)(de)損失是相當(dang)大的(de)(de)(de)，不產毒(du)等(deng)于前面所做(zuo)的(de)(de)(de)那么多工作全部(bu)白費，浪(lang)費人(ren)力、物力，尤其是時間(jian)上的(de)(de)(de)浪(lang)費，從培養細(xi)胞開始到接(jie)(jie)病(bing)毒(du)，到收液至少需要一兩(liang)個月(yue)，一旦出(chu)現(xian)不產毒(du)的(de)(de)(de)情(qing)況，那么這一兩(liang)月(yue)時間(jian)就(jiu)白白浪(lang)費掉了，這也(ye)是牛血清給(gei)(gei)疫苗(miao)企業造成的(de)(de)(de)風險之一。

5、細(xi)胞(bao)生長(chang)的(de)(de)狀態一(yi)般(ban)，產(chan)毒(du)少，毒(du)價(jia)(jia)低。這(zhe)種(zhong)情況比較(jiao)常見，細(xi)胞(bao)是病毒(du)的(de)(de)載體(ti)(ti)，由于血清質量不(bu)(bu)(bu)(bu)好(hao)，導(dao)致細(xi)胞(bao)生長(chang)狀態不(bu)(bu)(bu)(bu)好(hao)，病毒(du)就無法(fa)進行正常的(de)(de)復(fu)制(zhi)。并(bing)非(fei)所有(you)病毒(du)都不(bu)(bu)(bu)(bu)能復(fu)制(zhi)，所以就造成(cheng)疫苗(miao)的(de)(de)效價(jia)(jia)不(bu)(bu)(bu)(bu)夠，可(ke)能造成(cheng)不(bu)(bu)(bu)(bu)合格(ge)產(chan)品。

看來一款血清(qing)直(zhi)接(jie)關系細胞的生死存亡(wang)，不(bu)用(yong)擔心，慧穎(ying)提(ti)供(gong)無(wu)支原體，低(di)內毒(du)素和低(di)血紅素的，無(wu)反復凍融的高品(pin)質血清(qing)

慧穎生物熱賣血(xue)(xue)清(qing)(qing)主要有：A15-101胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，SH30084.03胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，SH30068.03胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，SFBS胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，900-108胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，F2442胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，10099141胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，16000044胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，，10270106胎(tai)牛(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，SH30074.03馬(ma)血(xue)(xue)清(qing)(qing)，04-001-1ACS胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)，S-FBS-SA-055超低胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)，S-FBS-SA-015胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)，S-FBS-US-065透(tou)析(xi)胎牛血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)，S-FBS-AU-045活性炭處理血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)等。