人(ren)雌二醇 （E2） ELISA試劑盒

（德國(guo)DRG：EIA2693）

1、前言說明(ming)

E2是(shi)一(yi)種含一(yi)個酚A環(huan)的(de)(de)(de)(de)(de)18C類固醇(chun)(chun)(chun)激(ji)(ji)素(su)。此(ci)類固醇(chun)(chun)(chun)激(ji)(ji)素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)分子(zi)(zi)量為(wei)272.4，它(ta)是(shi)人體(ti)(ti)(ti)中zui有(you)(you)效(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)雌(ci)(ci)(ci)激(ji)(ji)素(su)，主(zhu)要(yao)由(you)女性(xing)(xing)卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)巢的(de)(de)(de)(de)(de)格(ge)拉芬(fen)卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)泡(pao)和(he)(he)胎盤產(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)，少量由(you)腎上(shang)腺(xian)和(he)(he)男(nan)性(xing)(xing)睪(gao)丸產(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)。E2（雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)）被分泌到血(xue)(xue)液中，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)血(xue)(xue)液中有(you)(you)98%的(de)(de)(de)(de)(de)雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)會(hui)結合(he)(he)(he)到性(xing)(xing)激(ji)(ji)素(su)結合(he)(he)(he)蛋(dan)白(bai)上(shang)，有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)(de)還會(hui)結合(he)(he)(he)到其它(ta)血(xue)(xue)清蛋(dan)白(bai)上(shang)（如血(xue)(xue)清白(bai)蛋(dan)白(bai)），只有(you)(you)很(hen)少一(yi)部分以游離形(xing)式存在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)。雌(ci)(ci)(ci)激(ji)(ji)素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)活性(xing)(xing)會(hui)受(shou)(shou)到雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)受(shou)(shou)體(ti)(ti)(ti)符合(he)(he)(he)物的(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)，此(ci)符合(he)(he)(he)物可在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)靶位(wei)并(bing)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)核酸(suan)水(shui)平(ping)(ping)上(shang)引(yin)發相應(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)反應(ying)。這些靶位(wei)包(bao)括(kuo)：卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)泡(pao)、子(zi)(zi)宮、乳房、陰道(dao)、尿道(dao)、下丘腦、垂(chui)體(ti)(ti)(ti)和(he)(he)敏(min)感稍低的(de)(de)(de)(de)(de)肝臟與皮膚。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)月經(jing)周期(qi)(qi)正(zheng)常的(de)(de)(de)(de)(de)未(wei)懷孕女性(xing)(xing)體(ti)(ti)(ti)內，雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)的(de)(de)(de)(de)(de)分泌遵循著一(yi)種循環(huan)模式，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)排(pai)(pai)卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)前(qian)有(you)(you)兩(liang)個明顯的(de)(de)(de)(de)(de)高(gao)峰期(qi)(qi)。高(gao)濃(nong)度的(de)(de)(de)(de)(de)雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)可在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)垂(chui)體(ti)(ti)(ti)水(shui)平(ping)(ping)發揮正(zheng)反饋作(zuo)用(yong)，它(ta)會(hui)影(ying)響(xiang)垂(chui)體(ti)(ti)(ti)促性(xing)(xing)腺(xian)激(ji)(ji)素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)分泌,如卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)泡(pao)刺(ci)激(ji)(ji)素(su)和(he)(he)黃體(ti)(ti)(ti)生(sheng)(sheng)(sheng)成素(su)，前(qian)者是(shi)卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)泡(pao)成熟(shu)所(suo)必(bi)要(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)，后者是(shi)排(pai)(pai)卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)形(xing)成所(suo)必(bi)要(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)。排(pai)(pai)卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)后，雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)水(shui)平(ping)(ping)迅速(su)下降直到黃體(ti)(ti)(ti)細胞(bao)被激(ji)(ji)活，結果雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)水(shui)平(ping)(ping)出現第(di)二(er)(er)次高(gao)峰，并(bing)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)黃體(ti)(ti)(ti)階段達到一(yi)平(ping)(ping)衡述評(ping)。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)懷孕期(qi)(qi)間，母(mu)體(ti)(ti)(ti)血(xue)(xue)清雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)的(de)(de)(de)(de)(de)水(shui)平(ping)(ping)會(hui)極度的(de)(de)(de)(de)(de)增加，并(bing)且會(hui)超過排(pai)(pai)卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)前(qian)的(de)(de)(de)(de)(de)峰值，而且在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)整(zheng)個孕期(qi)(qi)維持在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)高(gao)水(shui)平(ping)(ping)上(shang)。血(xue)(xue)清雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)的(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測是(shi)評(ping)價各種月經(jing)功能障(zhang)礙的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)個有(you)(you)效(xiao)指標，例如女性(xing)(xing)早熟(shu)和(he)(he)晚熟(shu)，原發性(xing)(xing)、續發性(xing)(xing)閉經(jing)和(he)(he)絕經(jing)癥。據報(bao)道(dao)，女性(xing)(xing)化綜(zong)合(he)(he)(he)征(zheng)、男(nan)子(zi)(zi)女性(xing)(xing)型乳房和(he)(he)睪(gao)丸癌患(huan)者的(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)(xue)清雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)水(shui)平(ping)(ping)會(hui)升高(gao)。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)不孕患(huan)者體(ti)(ti)(ti)內，血(xue)(xue)清雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)的(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測有(you)(you)利于監(jian)測藥(yao)物治療(liao)（如克羅(luo)米酚檸檬酸(suan)鹽、促黃體(ti)(ti)(ti)生(sheng)(sheng)(sheng)成素(su)釋放激(ji)(ji)素(su)或(huo)外(wai)源性(xing)(xing)促性(xing)(xing)腺(xian)激(ji)(ji)素(su)）后排(pai)(pai)卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)的(de)(de)(de)(de)(de)感應(ying)情況(kuang)。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)因為(wei)體(ti)(ti)(ti)外(wai)受(shou)(shou)精(jing)而引(yin)起(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)巢過度刺(ci)激(ji)(ji)綜(zong)合(he)(he)(he)征(zheng)患(huan)者中，每(mei)天監(jian)測血(xue)(xue)清雌(ci)(ci)(ci)二(er)(er)醇(chun)(chun)(chun)濃(nong)度以便為(wei)hCG的(de)(de)(de)(de)(de)管理和(he)(he)卵(luan)(luan)(luan)(luan)(luan)母(mu)細胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)采集提供(gong)*時(shi)間。

2、檢測原理:

   DRG公司的(de)(de)雌(ci)(ci)二醇(chun)(chun)酶免試劑盒是(shi)一(yi)種(zhong)基(ji)于競爭(zheng)法原理的(de)(de)固相酶免吸(xi)附(fu)實驗（ELISA）。反應板上(shang)的(de)(de)微(wei)檢測(ce)孔包(bao)被有能結(jie)(jie)合雌(ci)(ci)二醇(chun)(chun)分子上(shang)*抗(kang)原位點的(de)(de)單克(ke)隆抗(kang)體。一(yi)份含有內源性(xing)雌(ci)(ci)二醇(chun)(chun)的(de)(de)病(bing)人(ren)樣(yang)本與(yu)辣根過氧(yang)酶標記的(de)(de)雌(ci)(ci)二醇(chun)(chun)競爭(zheng)性(xing)的(de)(de)結(jie)(jie)合包(bao)被板上(shang)的(de)(de)抗(kang)體。溫育(yu)之(zhi)后(hou)，未結(jie)(jie)合的(de)(de)酶聯物用洗(xi)滌液洗(xi)去。過氧(yang)酶與(yu)包(bao)被抗(kang)體的(de)(de)結(jie)(jie)合量與(yu)樣(yang)品中雌(ci)(ci)二醇(chun)(chun)的(de)(de)濃度(du)成反比。加入底物液后(hou)，所顯(xian)示的(de)(de)顏色強度(du)與(yu)病(bing)人(ren)樣(yang)品中雌(ci)(ci)二醇(chun)(chun)的(de)(de)濃度(du)成反比。

3、試劑盒成分(fen):

1） 包被板，12×8（可拆），96孔，微孔中包被了抗雌二醇的兔單克隆抗體。

2） 標(biao)準品：7支(zhi)1.0ml/支(zhi)。分別(bie)含量為：0；25；100；250；500；1000；2000pg/ml。 （1pg/ml=3.67pmol/L）

3） 酶(mei)聯結物(wu)：1支，25 ml，內(nei)含辣根過(guo)氧化物(wu)酶(mei)標記的雌二醇。

4） 底(di)物液：1支，內(nei)(nei)含(han)，14ml ，內(nei)(nei)含(han)TMB 

5） 終止液：1支，0.5M的 H₂SO₄，14ml，避免接觸終止液，以免造成刺激皮膚和著燒皮膚。

6） 洗滌(di)液（40×），1支，30ml

注：用(yong)于樣(yang)品稀(xi)釋(shi)的零標(biao)準品視需要而定(ding)。

4、實驗需要器(qi)材（但試(shi)劑盒不提供）

1） 酶標(biao)儀（450±10nm）。

2） 微量移液器和吸嘴(zui) 25μl、100μl、200μl。

3） 坐標(biao)紙。

4） 去離子水(shui)。

5、試劑貯存:

   未(wei)開啟的試劑在2—8℃下貯(zhu)存時(shi)，其活(huo)性在有(you)效期(qi)內穩(wen)定，不要使用(yong)過期(qi)試劑。所有(you)開封了的試劑都必(bi)須儲存于2-8℃的(de)環境下，微孔反應板也必須貯存(cun)于2—8℃的環境下。一旦包裝袋被打開(kai)，必(bi)須將它小心地嚴封起來(lai)。

6、試劑(ji)準備

實驗開始(shi)前，將所有(you)的(de)(de)試(shi)劑和所需數目的(de)(de)板條都平衡至室溫。

洗(xi)滌液(ye)：在30ml的濃縮(suo)洗(xi)滌液(ye)中(zhong)加入1170ml去離子水進行稀釋，稀釋好的洗(xi)滌液(ye)室(shi)溫下(xia)可穩定存放2周(zhou)。

7、樣本采(cai)集和準(zhun)備

7.1樣品的采(cai)集

血(xue)清：靜(jing)脈穿刺采(cai)集全血(xue)，待(dai)其凝血(xue)，室溫下離心(xin)獲取血(xue)清。

血漿(jiang)：將(jiang)全血收(shou)集(ji)到含抗凝(ning)劑的(de)離(li)心試(shi)管中，采集(ji)后立即離(li)心。

7.2樣品的儲存

實驗開始前，應當將(jiang)樣品(pin)用蓋(gai)子蓋(gai)好，2-8℃環境下可穩定(ding)存放(fang)5天。如果實(shi)驗前想(xiang)要將(jiang)樣(yang)品(pin)存放(fang)更長的時間，則(ze)應將(jiang)樣(yang)品(pin)凍存于-20℃的環境下。解凍的樣品在實驗(yan)前應反(fan)復倒置幾次。

7.3樣(yang)品(pin)的稀(xi)釋

在(zai)*實(shi)驗時，如果(guo)血清樣品(pin)(pin)中(zhong)(zhong)睪(gao)酮的(de)濃(nong)度(du)高于(yu)zui高標(biao)準品(pin)(pin)中(zhong)(zhong)睪(gao)酮的(de)濃(nong)度(du)，則(ze)應將此(ci)樣品(pin)(pin)用零標(biao)準品(pin)(pin)稀(xi)釋10或100倍，并按實(shi)驗步驟(zou)重新檢測。在(zai)計算(suan)濃(nong)度(du)時應當(dang)將此(ci)稀(xi)釋因(yin)子考慮進去。

例(li)如：

a） 按1：10的比例稀釋：10μl的血清+90μl零標準品（充分(fen)混合）

b） 按1：100的(de)比例稀釋(shi)：10μl已稀釋(shi)好的(de)a）+90μl零標準(zhun)品（充分混(hun)合）

8、實驗步(bu)驟:

所有(you)的(de)(de)標準品(pin)、樣(yang)品(pin)和質控品(pin)都(dou)做雙份檢(jian)測(ce)以(yi)保證(zheng)所有(you)的(de)(de)檢(jian)測(ce)條(tiao)件都(dou)相同。

1） 將所(suo)需數量(liang)的板(ban)(ban)條固定到板(ban)(ban)架上。

2） 將標準(zhun)品、質控品和已稀釋好的(de)(de)樣(yang)品分別用新的(de)(de)取樣(yang)吸頭取25μL加入(ru)到(dao)相應的(de)(de)微孔中。

3） 在每一微孔中加(jia)入200μL酶聯(lian)物。

4） 充分混勻10秒，在(zai)這個步(bu)驟*混勻很(hen)重要(yao)。

5） 室(shi)溫(wen)孵育120分種。

6） 快速(su)棄去孔內反(fan)應物，每孔用400μL洗滌液洗板(ban)3次，在(zai)吸水紙上拍(pai)干。注意：洗板(ban)步(bu)驟是否正確操作會(hui)明顯(xian)影響實驗(yan)的靈敏度(du)和精(jing)確度(du)。

7） 在(zai)每一微孔(kong)中(zhong)加入100μl底(di)物液。

8） 室溫孵育15分種。

9） 加(jia)50μl終止液到每個檢測孔中(zhong)終止酶(mei)反(fan)應。

10） 加(jia)終止(zhi)液后10分(fen)鐘(zhong)之內，用酶標儀在450±10nm處測定(ding)OD 值(zhi)。

9、結(jie)果計(ji)算:

1） 計算每(mei)個(ge)標(biao)準(zhun)品、質控品和病(bing)人樣(yang)本(ben)的(de)平均(jun)吸光度值。

2） 用(yong)吸光度值(zhi)作為縱(zong)坐標(biao)(biao)（y），濃(nong)(nong)度值(zhi)作為橫坐標(biao)(biao)（x），以每個標(biao)(biao)準品的(de)吸光度值(zhi)對其相應的(de)濃(nong)(nong)度值(zhi)進行標(biao)(biao)繪(hui)，作一標(biao)(biao)準曲線(xian)。

3） ;用每一樣品的平均吸光度(du)值在標(biao)準曲線上確定(ding)其(qi)相應(ying)的濃度(du)。

4） 自動(dong)計算(suan)方法：在IFU上，它用四參數曲線已自動(dong)計算(suan)出結果。其它的(de)歸納方法可能會得(de)出稍微不同的(de)結果。

5） 樣(yang)品(pin)的濃(nong)(nong)度(du)可直接(jie)從標(biao)準曲線上(shang)讀取。樣(yang)品(pin)中HPL濃(nong)(nong)度(du)高于zui高標(biao)準品(pin)的必須用進行(xing)進一步(bu)的稀(xi)(xi)釋。在計算樣(yang)品(pin)濃(nong)(nong)度(du)時就(jiu)應當把此稀(xi)(xi)釋因子考慮(lv)進去(qu)。

10、參考值

我們強(qiang)烈建議各個(ge)實驗市都建立自己的(de)正常(chang)值和異常(chang)值。在一明顯正常(chang)人群的(de)研究中，我們使用DRG公司(si)的(de)雌二醇(chun)ELISA試劑盒進行檢測得到(dao)如下結果(guo)：

 本譯文(wen)僅供(gong)參考，詳情(qing)請以原文(wen)為準。