Percoll 細胞分離液

（一(yi)）　原理

Percoll是一種包有乙(yi)烯吡咯烷(wan)酮的硅(gui)膠顆粒。滲(shen)透壓很(hen)低(di)（<20mosm／kg H２O）, 粘度也(ye)很(hen)小，可(ke)形成高達1.3g／ml密度，采(cai)用(yong)(yong)預先(xian)形成的密度梯度時可(ke)在(zai)低(di)離心力（200～1000g）于(yu)數(shu)分至(zhi)數(shu)十分鐘(zhong)內達到滿意(yi)的細胞(bao)(bao)分離結果。由 于(yu)Percoll擴散常數(shu)低(di)，所(suo)形成的梯度十分穩定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞(bao)(bao)無毒(du)害，因此廣泛用(yong)(yong)于(yu)分離細胞(bao)(bao)、亞(ya)細胞(bao)(bao)成分、細菌及(ji)病毒(du)， 還可(ke)將(jiang)受損(sun)細胞(bao)(bao)及(ji)其碎片與完好的活細胞(bao)(bao)分離。

（二(er)）操作方法(fa)及注意事項(xiang)

1.不同(tong)濃(nong)度（密度）Percoll溶(rong)液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混(hun)合達(da)到生理(li)性滲透壓(ya)，然后用生理(li)溶(rong)液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃(nong)度。

Percoll濃(nong)度（％）　　70　　　　60　　　　50　　　　40　　　　30　　　　　20

比重g／ml　　　1.090&nbsp;        1.077         1.067          1.056&nbsp;           1.043               1.031

2. 　不(bu)連續密度梯度Percoll層(ceng)的(de)制備(bei): 先將(jiang)試管(guan)壁(bi)用牛(niu)血清(qing)濕潤，除去多余(yu)血清(qing)，這種預處理可使(shi)逐層(ceng)疊加的(de)Percoll液平穩沿管(guan)壁(bi)流下(xia)，使(shi)形成滿意的(de)界(jie)面。在(zai)制備(bei)過程中一般用長針頭注射(she)器從 高密度向低密度逐層(ceng)放(fang)置(zhi)，有時(shi)(shi)相鄰兩層(ceng)Percoll比重相差(cha)不(bu)大時(shi)(shi)，可將(jiang)Percoll液放(fang)入(ru)注射(she)器中，小針頭斜面緊貼(tie)管(guan)壁(bi)，任其自然慢慢流下(xia)。

3.　裝樣(yang)(yang)：樣(yang)(yang)品體積和細(xi)胞(bao)(bao)濃度(du)根據不同細(xi)胞(bao)(bao)而異，一般加樣(yang)(yang)體積不宜過(guo)大，細(xi)胞(bao)(bao)濃度(du)也不可(ke)過(guo)高，否則會影響(xiang)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)分離(li)和回收。

4.　離(li)心：一般(ban)采用離(li)心力為400g，時間(jian)20～25min。由于多層Percoll之間(jian)密度差別不大，因此離(li)心機加速(su)、降(jiang)速(su)時要(yao)慢，要(yao)平穩。

5.　取(qu)樣：當所要(yao)分離的(de)(de)細胞絕大部(bu)分在(zai)兩層(ceng)的(de)(de)界(jie)面(mian)時，可(ke)逐(zhu)層(ceng)去(qu)除Percoll液(ye)后收集界(jie)面(mian)部(bu)位的(de)(de)細胞;有(you)時大部(bu)分細胞位于Percoll層(ceng)中,則需要(yao)逐(zhu)層(ceng)收集。收獲含有(you)Percoll液(ye)的(de)(de)細胞經(jing)2次洗滌后可(ke)供培養或檢測用。

Percoll 細胞分離液