人結腸癌細(xi)胞(bao)(bao)系：SW48細(xi)胞(bao)(bao)，SW480細(xi)胞(bao)(bao)，CACO-2細(xi)胞(bao)(bao)，SW620細(xi)胞(bao)(bao)，HCT-8細(xi)胞(bao)(bao)，HCT/V細(xi)胞(bao)(bao)，HCT-116細(xi)胞(bao)(bao)，LoVo細(xi)胞(bao)(bao)，HRT-18細(xi)胞(bao)(bao)，HT-29細(xi)胞(bao)(bao)等

人宮(gong)頸癌細(xi)胞(bao)(bao)(bao)系：hela細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，HT-3細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，C33A細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，SN12C細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，SKG-IIIa細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，Hela S3細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，DoTc2-4510細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，Ca Ski細(xi)胞(bao)(bao)(bao) ，ME-180細(xi)胞(bao)(bao)(bao)等

人卵巢(chao)細(xi)(xi)胞(bao)系：KGN細(xi)(xi)胞(bao)，COV434細(xi)(xi)胞(bao)，IOSE80細(xi)(xi)胞(bao)，SKOV3細(xi)(xi)胞(bao)，OVCAR3細(xi)(xi)胞(bao)，HEY細(xi)(xi)胞(bao)等(deng)

DC2.4細(xi)(xi)胞株(zhu)  MC38細(xi)(xi)胞株(zhu)，MLE-12細(xi)(xi)胞，bEND.3細(xi)(xi)胞 HT-22細(xi)(xi)胞，HK-2細(xi)(xi)胞 THP-1細(xi)(xi)胞 WRO細(xi)(xi)胞 FRO細(xi)(xi)胞 Molt-4細(xi)(xi)胞系 SH-SY-5Y細(xi)(xi)胞 U87-MG細(xi)(xi)胞

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c3h10t1/2細胞，鼠間充(chong)質細胞株 （細胞培養中常見的(de)生物污(wu)染(ran)(ran)(ran)類型有(you)7種，分別是(shi)細菌污(wu)染(ran)(ran)(ran)、支原(yuan)體污(wu)染(ran)(ran)(ran)、原(yuan)蟲污(wu)染(ran)(ran)(ran)、黑(hei)膠蟲污(wu)染(ran)(ran)(ran)、真(zhen)菌污(wu)染(ran)(ran)(ran)、病(bing)毒污(wu)染(ran)(ran)(ran)以及非細胞污(wu)染(ran)(ran)(ran)，那么他們污(wu)染(ran)(ran)(ran)細胞的(de)特點分別是(shi)什么呢？怎樣能(neng)夠減少(shao)污(wu)染(ran)(ran)(ran)現(xian)象(xiang)的(de)發生？）

1-細菌(jun)

細菌(jun)(jun)污(wu)染(ran)(ran)常見的有大(da)腸(chang)桿菌(jun)(jun)，葡萄球菌(jun)(jun)等。細菌(jun)(jun)污(wu)染(ran)(ran)較易發現，在普通(tong)倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，培(pei)養液一般(ban)會(hui)在短(duan)時間(jian)內(nei)變黃，有時靜置的培(pei)養液不(bu)混，稍加震蕩會(hui)有很多混濁物(wu)漂(piao)起。顯微鏡下可見培(pei)養液中(zhong)有大(da)量(liang)圓球狀顆(ke)粒物(wu)漂(piao)浮(fu)，有時在細胞(bao)表面及周圍有大(da)量(liang)細菌(jun)(jun)存在，細胞(bao)停止生長并有中(zhong)毒表現。

處(chu)理：①在(zai)培養液(ye)中加入相應(ying)的(de)抗生素，能夠預防絕大多(duo)數的(de)細菌(jun)污染(ran)。

2-真菌

真菌(jun)污染是細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養過(guo)程中zui常(chang)見(jian)的一種(zhong)，尤其梅雨季節快要到了，進行細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養時更(geng)易污染。污染細(xi)胞(bao)的多為(wei)煙曲霉(mei)、黑曲霉(mei)、毛霉(mei)菌(jun)、孢(bao)子霉(mei)、白念珠(zhu)菌(jun)、酵母菌(jun)等。霉(mei)菌(jun)污染后多數在培(pei)(pei)養液中形成白色或(huo)淺黃色漂浮(fu)物。一般肉眼(yan)可見(jian)，較易被發現，短(duan)期內(nei)培(pei)(pei)養液多不(bu)混(hun)濁，倒置顯微鏡下可見(jian)于細(xi)胞(bao)之間縱(zong)橫交錯穿(chuan)行的絲狀、管狀、及(ji)樹枝狀菌(jun)絲，并懸(xuan)浮(fu)飄(piao)蕩(dang)在培(pei)(pei)養液中。

很多菌(jun)絲在高(gao)倍鏡(jing)可見到有(you)鏈(lian)狀排(pai)列的(de)菌(jun)珠(zhu)；念(nian)珠(zhu)菌(jun)或酵母菌(jun)形(xing)(xing)態呈卵形(xing)(xing)，散在細(xi)胞周邊和細(xi)胞之間生(sheng)(sheng)長。鏡(jing)下看時，要將(jiang)培養瓶用酒(jiu)精棉(mian)球擦干(gan)凈，以(yi)防止與瓶外尤其瓶底外面生(sheng)(sheng)長的(de)菌(jun)絲相混淆。

真菌(jun)污(wu)(wu)染(ran)后(hou)，細(xi)(xi)胞(bao)生長變慢(man)，但zui后(hou)由于營(ying)養(yang)耗盡及毒性作用而使細(xi)(xi)胞(bao)脫落死亡。真菌(jun)生長的(de)比較慢(man)，不象細(xi)(xi)菌(jun)那么(me)容(rong)易被發(fa)現(xian)，但是一旦發(fa)現(xian)有它的(de)存在細(xi)(xi)胞(bao)就被污(wu)(wu)染(ran)了，也很難救活了。

3-支原體(ti)

支(zhi)原(yuan)體(ti)的大小(xiao)介于細菌(jun)和病毒之間，是一種獨(du)立生(sheng)活(huo)的微生(sheng)物。對(dui)熱敏感(gan)，對(dui)一般抗生(sheng)素(su)不敏感(gan)。支(zhi)原(yuan)體(ti)的形態多變，多吸附在(zai)細胞(bao)表面(mian)和細胞(bao)之間。電鏡下觀(guan)察，中心(xin)有高密度(du)的密集顆(ke)粒，橫斷(duan)面(mian)與(yu)細胞(bao)微絨毛相似。

因(yin)國內(nei)的(de)血清大多(duo)數都(dou)沒有做支(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)陰性檢測(ce)，而支(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)又是(shi)牛血清中zui常見的(de)微(wei)(wei)生(sheng)物之一。支(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)污(wu)染細(xi)(xi)胞(bao)(bao)后，培養(yang)液輕(qing)微(wei)(wei)發(fa)生(sheng)混濁．但(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)變化不顯(xian)著，隨(sui)著細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)培養(yang)會慢(man)慢(man)死亡(wang)。

支(zhi)原體(ti)(ti)(ti)污染檢測（熒(ying)光染色(se)法(fa)）：DNA和與DNA特異性(xing)結(jie)合(he)的(de)(de)熒(ying)光染料結(jie)合(he)，使得支(zhi)原體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)DNA著色(se)，然后用熒(ying)光顯微鏡觀察。鏡下支(zhi)原體(ti)(ti)(ti)為(wei)散在于細(xi)胞(bao)同(tong)圍或附于細(xi)胞(bao)膜表面(mian)的(de)(de)亮綠色(se)小點。

解決：

1）抗(kang)生素(su)排除法(fa)：支原體(ti)污染預防(fang)比解決好。如(ru)果不(bu)小心污染后，可加入高濃(nong)(nong)度抗(kang)生素(su)（常規(gui)使用(yong)的5倍(bei)濃(nong)(nong)度）作用(yong)24-48小時，再換入常規(gui)培養(yang)液(ye)，但該法(fa)不(bu)保證有(you)效。推薦用(yong)量：慶大霉(mei)(mei)素(su) 200μg/ml ,四環(huan)素(su)10μg/ml ，卡那霉(mei)(mei)素(su)50μg/ml 。

2）加(jia)溫(wen)除菌(jun)：支原體不耐(nai)熱(re)，可以對支原體污染的細(xi)胞(bao)熱(re)處理(li)除菌(jun)。因高溫(wen)對細(xi)胞(bao)本(ben)身(shen)也(ye)會產(chan)生一(yi)定(ding)影(ying)響，故熱(re)處理(li)前需先(xian)進行預實驗，確定(ding)對細(xi)胞(bao)影(ying)響zui小(xiao)而能zui大程度(du)的殺死支原體的時間。

4-黑膠蟲(chong)

黑膠蟲的存(cun)在目前尚有(you)爭議(yi)，其在低倍下為黑色點(dian)狀(zhuang)，高(gao)倍下可看見黑色的小蟲游來游去(qu)，培養液(ye)也是不(bu)渾的，對細胞生長狀(zhuang)態(tai)不(bu)會有(you)明顯影(ying)響，在細胞增殖旺盛(sheng)之后會自然消失，除更換(huan)血清外(wai)無須(xu)特殊處理。

5-原蟲

培養液可(ke)輕微渾(hun)濁，顯(xian)微鏡下那(nei)些細(xi)(xi)小(xiao)的(de)(de)點狀物數量(liang)非常多，輕微活動，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)雖然(ran)可(ke)以生(sheng)長但繁(fan)殖速度卻明顯(xian)減慢，而且細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)狀態不(bu)(bu)好，邊緣不(bu)(bu)清楚(chu)，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)不(bu)(bu)透亮(liang)。他們(men)與細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可(ke)共生(sheng)但會(hui)與細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)爭奪(duo)營養。這種共生(sheng)是非常普(pu)遍的(de)(de)，但他們(men)的(de)(de)數量(liang)小(xiao)，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)站(zhan)優(you)勢(shi)所以不(bu)(bu)會(hui)影響(xiang)到(dao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)正(zheng)常生(sheng)長，只有當他們(men)到(dao)達一定的(de)(de)數量(liang)時就會(hui)影響(xiang)到(dao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)生(sheng)長，zui終形成(cheng)惡性(xing)循環。

6-病(bing)毒(du)

組織細胞(bao)培(pei)養過(guo)程中(zhong)，如果沒有除去潛(qian)(qian)在的(de)病(bing)毒(du)(du)(du)，就會產生病(bing)毒(du)(du)(du)污染(ran)。目前，從原代猴腎細胞(bao)的(de)培(pei)養中(zhong)已發現不(bu)少于20種血清性病(bing)毒(du)(du)(du)。 盡(jin)管病(bing)毒(du)(du)(du)污染(ran)的(de)細胞(bao)不(bu)影響原代培(pei)養，但生產疫苗是不(bu)安(an)全(quan)的(de)。因此，潛(qian)(qian)在病(bing)毒(du)(du)(du)是細胞(bao)大量生產和疫苗、干擾(rao)素等(deng)生物制品制作中(zhong)的(de)難題(ti)。

7-非同(tong)種細胞污染

即細(xi)胞(bao)交叉污染(ran)，由于細(xi)胞(bao)培養操作時各(ge)細(xi)胞(bao)株所(suo)需的(de)(de)器材和溶液沒有嚴格分(fen)開，往(wang)往(wang)會使一(yi)種(zhong)(zhong)細(xi)胞(bao)被另一(yi)種(zhong)(zhong)細(xi)胞(bao)污染(ran)。目前，世(shi)界上已有幾(ji)十種(zhong)(zhong)細(xi)胞(bao)都(dou)被HeLa細(xi)胞(bao)所(suo)污染(ran)，致(zhi)使許(xu)多實驗宣告無效。非(fei)細(xi)胞(bao)培養物(wu)(wu)所(suo)造成的(de)(de)化學成分(fen)的(de)(de)污染(ran)也偶有發生，大多是由于細(xi)胞(bao)培養所(suo)需物(wu)(wu)品清洗消毒不*而(er)帶入一(yi)些有毒化學物(wu)(wu)質所(suo)致(zhi)。

污(wu)染(ran)是細胞(bao)培(pei)養的(de)(de)大敵(di)，預防和避免污(wu)染(ran)是成功(gong)培(pei)養細胞(bao)的(de)(de)關鍵之一。危機意(yi)識要貫徹實驗的(de)(de)始終(zhong)，否(fou)則不僅(jin)浪費時間(jian)，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的(de)(de)損(sun)失。

  （如何預防細胞培養的污染和清除這些污染物呢？）慧穎 細胞庫 技術為您解答：

一、污染的預(yu)防

預(yu)(yu)防(fang)(fang)是(shi)防(fang)(fang)止細胞(bao)培養(yang)過程(cheng)中(zhong)發(fa)生(sheng)污染(ran)的辦法(fa)。只有預(yu)(yu)防(fang)(fang)工作做在(zai)前，才(cai)能將發(fa)生(sheng)污染(ran)的可(ke)能性降(jiang)到zui小程(cheng)度(du)。一般預(yu)(yu)防(fang)(fang)可(ke)從以下幾(ji)方面著手：

1-從操作(zuo)者做起

1操(cao)作(zuo)者責任(ren)心要(yao)(yao)(yao)強，要(yao)(yao)(yao)細(xi)心穩重，操(cao)作(zuo)技術要(yao)(yao)(yao)熟(shu)練。進無菌(jun)室前要(yao)(yao)(yao)用(yong)肥(fei)皂洗手(shou)或(huo)(huo)用(yong)5%新潔爾滅浸泡5分(fen)鐘，按(an)規定穿隔離衣。進入(ru)后關好門，坐(zuo)下來盡量少走動。工作(zuo)開始要(yao)(yao)(yao)先用(yong)75%酒精棉球擦手(shou)、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要(yao)(yao)(yao)嚴格(ge)檢查器材、溶液(ye)和培養(yang)物，不(bu)要(yao)(yao)(yao)把污染品或(huo)(huo)未經(jing)消毒(du)的(de)物品帶入(ru)無菌(jun)室內，更不(bu)能隨便使用(yong)，以免造(zao)成大(da)批污染。

2、操(cao)作(zuo)(zuo)者動作(zuo)(zuo)要輕，必(bi)須(xu)在火焰(yan)周圍無菌區內打開瓶口，并將瓶口轉動燒灼。操(cao)作(zuo)(zuo)時盡量不要談話，若打噴嚏或咳(ke)嗽應轉向背面。

3、操作時要常更(geng)換吸管，切(qie)勿一根吸管做到底。一旦發現吸管口接觸(chu)了(le)手和其他(ta)污染物品應棄去。實驗完畢及時收拾，保持實驗室清潔(jie)整齊，zui后用消毒水浸(jin)泡的紗(sha)布擦(ca)臺面。

2-從物品、用(yong)品消(xiao)毒滅(mie)菌著手

細胞培養所用物品(pin)清(qing)洗、消毒(du)要(yao)(yao)(yao)*，各種溶液滅菌除菌要(yao)(yao)(yao)仔細，并在無(wu)(wu)菌試驗陰(yin)性后才能使(shi)用。操作室及剩余的(de)無(wu)(wu)菌器材要(yao)(yao)(yao)定期清(qing)潔消毒(du)滅菌。

3-防止(zhi)細胞交叉(cha)污染

在(zai)進行多(duo)種細(xi)胞培養(yang)操作時，所用器具要嚴格區(qu)分，做上標記便于辨別。并按順(shun)序(xu)進行操作，避免一(yi)起進行時易發生混亂。

在進行換液(ye)或傳代操作時，注(zhu)射器和(he)滴管(guan)不(bu)要觸及(ji)細(xi)胞培養(yang)瓶(ping)瓶(ping)口，以免把細(xi)胞帶(dai)到培養(yang)液(ye)中污染(ran)其他細(xi)胞。

所有細胞一旦購置，或(huo)從別(bie)處(chu)引(yin)入(ru)，或(huo)自己建立，均應及早留種凍(dong)存，一旦發生(sheng)污染(ran)可(ke)棄(qi)之復(fu)蘇，重新培(pei)養。

二、污染的清除

培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)(bao)一經污染(ran)，多數較(jiao)難(nan)處理(li)。如(ru)果污染(ran)細(xi)胞(bao)(bao)價值不(bu)大，宜棄之；有細(xi)胞(bao)(bao)株留存(cun)的或可購置的，可在尋找(zhao)原(yuan)因后*消毒操作(zuo)室，復蘇(su)或重新購置細(xi)胞(bao)(bao)，再(zai)培(pei)養(yang)。若污染(ran)細(xi)胞(bao)(bao)價值較(jiao)大，又難(nan)于重新得到(dao)，可采取以(yi)下辦法清除。

1-使用抗(kang)生素

抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)(su)(su)對(dui)殺滅細菌較有效。聯合用(yong)(yong)(yong)(yong)藥比(bi)單(dan)獨用(yong)(yong)(yong)(yong)藥效果(guo)好(hao)。預防(fang)用(yong)(yong)(yong)(yong)藥比(bi)污(wu)(wu)染后再(zai)用(yong)(yong)(yong)(yong)藥效果(guo)好(hao)。預防(fang)用(yong)(yong)(yong)(yong)藥一般用(yong)(yong)(yong)(yong)雙抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)(su)(su)（青(qing)(qing)霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)100u/mL加(jia)鏈霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)100μg/mL），污(wu)(wu)染后清除(chu)用(yong)(yong)(yong)(yong)藥需采用(yong)(yong)(yong)(yong)大于(yu)常(chang)(chang)(chang)(chang)用(yong)(yong)(yong)(yong)量5～10倍的(de)沖洗法(fa)，于(yu)加(jia)藥后作用(yong)(yong)(yong)(yong)24～48小時，再(zai)換常(chang)(chang)(chang)(chang)規培(pei)養(yang)(yang)(yang)液。此法(fa)在污(wu)(wu)染早(zao)期可能有效。所(suo)用(yong)(yong)(yong)(yong)抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)(su)(su)品種除(chu)青(qing)(qing)霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)、鏈霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)外，還可用(yong)(yong)(yong)(yong)慶大霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)、卡那霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)、多粘(zhan)菌素(su)(su)(su)(su)(su)、四環(huan)(huan)素(su)(su)(su)(su)(su)、制霉(mei)菌素(su)(su)(su)(su)(su)等。常(chang)(chang)(chang)(chang)用(yong)(yong)(yong)(yong)400～800μg/mL卡那霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)或(huo)200μg/mL四環(huan)(huan)素(su)(su)(su)(su)(su)處理，每隔2～3日換液1次(ci)(ci)，傳1～2代進(jin)行治療(liao)。近年來有報道，4-氟(fu)，2-羥(qian)基喹啉（Ciprofloxacin,Cip）、截耳素(su)(su)(su)(su)(su)衍(yan)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)（Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huan)(huan)素(su)(su)(su)(su)(su)衍(yan)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)（BM-2）等三種抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)(su)(su)單(dan)用(yong)(yong)(yong)(yong)或(huo)合用(yong)(yong)(yong)(yong)對(dui)殺滅支原(yuan)體有效。這三種抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)(su)(su)均用(yong)(yong)(yong)(yong)PBS配成250濃縮(suo)液，-20℃保存備用(yong)(yong)(yong)(yong)，使用(yong)(yong)(yong)(yong)濃度Cip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL。使用(yong)(yong)(yong)(yong)時先吸除(chu)污(wu)(wu)染的(de)培(pei)養(yang)(yang)(yang)液，加(jia)入含BM-1的(de)RPMI1640培(pei)養(yang)(yang)(yang)液，3天后再(zai)吸除(chu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)液，加(jia)入含BM-2的(de)RPMI1640培(pei)養(yang)(yang)(yang)液，培(pei)養(yang)(yang)(yang)4天，如此連續3個(ge)輪次(ci)(ci)，直(zhi)至(zhi)用(yong)(yong)(yong)(yong)33258熒光(guang)染色鏡(jing)檢(jian)證明(ming)已清除(chu)支原(yuan)體后，再(zai)加(jia)正(zheng)常(chang)(chang)(chang)(chang)培(pei)養(yang)(yang)(yang)液培(pei)養(yang)(yang)(yang)傳代3-4次(ci)(ci)。

2-使用支(zhi)原體特異性血清(qing)

用5%的兔支原(yuan)體免疫血清（血凝效價1:320以上(shang)）可去除(chu)支原(yuan)體污染，因特異抗(kang)體可抑制支原(yuan)體生長，故經抗(kang)血清處理后11天即轉為(wei)陰性(xing)，并且5個(ge)月(yue)后仍為(wei)陰性(xing)。但此法比較麻煩，不如用抗(kang)生素方便、經濟。

3-加溫(wen)處理

將污染的組(zu)織培養(yang)物(wu)放(fang)在(zai)41℃培養(yang)18小時，可殺死支原體，但(dan)對(dui)細胞有不(bu)良(liang)影(ying)響(xiang)。所以(yi)(yi)在(zai)處理前要進行預試(shi)驗(yan)，摸(mo)索能zui大限(xian)度殺死支原體又對(dui)細胞影(ying)響(xiang)zui小的加熱時間。此法有時不(bu)可靠。若先用藥物(wu)處理后，再以(yi)(yi)41℃加溫(wen)處理效(xiao)果更佳。

4-其(qi)他方(fang)法

除了上述去(qu)除污(wu)染(ran)的方法(fa)外，還有動物體(ti)(ti)內接種除菌法(fa)、巨噬(shi)(shi)細胞吞(tun)噬(shi)(shi)法(fa)、污(wu)染(ran)培(pei)養瓶中加(jia)溴尿嘧啶(ding)再用光照射的方法(fa)及(ji)過濾法(fa)等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一(yi)(yi)旦支原體(ti)(ti)污(wu)染(ran)，除非(fei)有特別重要價值(zhi)，一(yi)(yi)般均棄之(zhi)重新培(pei)養。

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