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HOC-2細胞,人卵巢透明癌細胞(細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)中常見的生(sheng)物污(wu)(wu)(wu)染(ran)類型有7種,分別(bie)是細(xi)(xi)(xi)(xi)菌(jun)污(wu)(wu)(wu)染(ran)、支原體(ti)污(wu)(wu)(wu)染(ran)、原蟲(chong)污(wu)(wu)(wu)染(ran)、黑膠(jiao)蟲(chong)污(wu)(wu)(wu)染(ran)、真(zhen)菌(jun)污(wu)(wu)(wu)染(ran)、病毒污(wu)(wu)(wu)染(ran)以及(ji)非細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)污(wu)(wu)(wu)染(ran),那么他們污(wu)(wu)(wu)染(ran)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)的特點(dian)分別(bie)是什么呢?怎樣(yang)能夠減(jian)少污(wu)(wu)(wu)染(ran)現象的發生(sheng)?)
1-細菌
細菌(jun)(jun)(jun)污染常(chang)見(jian)的有(you)大(da)(da)腸(chang)桿菌(jun)(jun)(jun),葡萄球(qiu)菌(jun)(jun)(jun)等(deng)。細菌(jun)(jun)(jun)污染較易發現,在(zai)普(pu)通倒置顯(xian)(xian)微鏡下為黑色細沙狀,培(pei)養液(ye)一般(ban)會(hui)在(zai)短時(shi)(shi)間內變黃,有(you)時(shi)(shi)靜置的培(pei)養液(ye)不混(hun),稍加震蕩會(hui)有(you)很多混(hun)濁物(wu)漂(piao)起。顯(xian)(xian)微鏡下可(ke)見(jian)培(pei)養液(ye)中有(you)大(da)(da)量(liang)圓球(qiu)狀顆粒物(wu)漂(piao)浮,有(you)時(shi)(shi)在(zai)細胞表面及周圍有(you)大(da)(da)量(liang)細菌(jun)(jun)(jun)存在(zai),細胞停(ting)止生(sheng)長并有(you)中毒表現。
處理:①在(zai)培(pei)養(yang)液中(zhong)加入相(xiang)應的抗生素,能(neng)夠(gou)預防絕大多數的細(xi)菌污染。
2-真菌
真菌污(wu)(wu)染是細胞(bao)培(pei)養(yang)過程中(zhong)zui常見的一種,尤(you)其(qi)梅雨(yu)季(ji)節快要到了,進(jin)行細胞(bao)培(pei)養(yang)時更易(yi)污(wu)(wu)染。污(wu)(wu)染細胞(bao)的多為煙曲霉(mei)、黑曲霉(mei)、毛霉(mei)菌、孢子霉(mei)、白(bai)念珠菌、酵母菌等(deng)。霉(mei)菌污(wu)(wu)染后多數在培(pei)養(yang)液(ye)(ye)中(zhong)形成白(bai)色或淺黃色漂浮(fu)物。一般(ban)肉眼可(ke)見,較易(yi)被發(fa)現(xian),短期內培(pei)養(yang)液(ye)(ye)多不混濁,倒置(zhi)顯微鏡下(xia)可(ke)見于(yu)細胞(bao)之間(jian)縱橫交錯穿行的絲狀(zhuang)、管(guan)狀(zhuang)、及樹枝狀(zhuang)菌絲,并懸浮(fu)飄蕩在培(pei)養(yang)液(ye)(ye)中(zhong)。
很多菌(jun)(jun)絲在高倍鏡可見到有(you)鏈(lian)狀排列的菌(jun)(jun)珠(zhu);念珠(zhu)菌(jun)(jun)或酵母菌(jun)(jun)形(xing)(xing)態呈卵形(xing)(xing),散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下(xia)看(kan)時,要將(jiang)培養瓶(ping)用酒精(jing)棉球擦干凈,以防(fang)止與(yu)瓶(ping)外(wai)尤其(qi)瓶(ping)底(di)外(wai)面(mian)生長的菌(jun)(jun)絲相混(hun)淆。
真(zhen)菌污(wu)染后,細(xi)胞生長(chang)變慢,但zui后由(you)于營養耗盡(jin)及毒性作(zuo)用而使細(xi)胞脫落死亡。真(zhen)菌生長(chang)的比(bi)較慢,不象細(xi)菌那么(me)容易(yi)被發現(xian),但是一旦發現(xian)有它的存在細(xi)胞就被污(wu)染了,也很難救活(huo)了。
3-支(zhi)原體
支原體的(de)大小(xiao)介于細(xi)(xi)菌和病毒之間(jian),是一(yi)(yi)種獨立生(sheng)(sheng)活的(de)微(wei)生(sheng)(sheng)物。對(dui)熱敏感,對(dui)一(yi)(yi)般抗生(sheng)(sheng)素不敏感。支原體的(de)形態(tai)多變,多吸(xi)附(fu)在細(xi)(xi)胞(bao)表面(mian)和細(xi)(xi)胞(bao)之間(jian)。電鏡(jing)下觀察,中心有高(gao)密度(du)的(de)密集顆粒,橫斷面(mian)與細(xi)(xi)胞(bao)微(wei)絨毛相似。
因國(guo)內的(de)(de)血(xue)清大多(duo)數都沒有做支(zhi)原(yuan)體(ti)陰性檢(jian)測,而支(zhi)原(yuan)體(ti)又是(shi)牛血(xue)清中(zhong)zui常(chang)見的(de)(de)微生物之(zhi)一。支(zhi)原(yuan)體(ti)污(wu)染細胞(bao)后,培養液輕微發生混濁.但細胞(bao)變化不顯著,隨著細胞(bao)的(de)(de)培養會慢慢死亡。
支原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)污(wu)染(ran)(ran)檢測(熒光(guang)(guang)染(ran)(ran)色法):DNA和(he)與(yu)DNA特異(yi)性結合的熒光(guang)(guang)染(ran)(ran)料結合,使得支原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)的DNA著色,然后用(yong)熒光(guang)(guang)顯微(wei)鏡(jing)觀察。鏡(jing)下支原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)為散在于細胞同圍或附于細胞膜表(biao)面的亮(liang)綠色小點。
解(jie)決:
1)抗生素(su)(su)(su)(su)排除(chu)法:支(zhi)原體污染(ran)預(yu)防比解決好。如(ru)果(guo)不(bu)小心污染(ran)后,可加入高濃(nong)度(du)抗生素(su)(su)(su)(su)(常(chang)規使用的5倍濃(nong)度(du))作用24-48小時,再(zai)換(huan)入常(chang)規培(pei)養液,但該法不(bu)保證(zheng)有效。推薦用量:慶大霉(mei)素(su)(su)(su)(su) 200μg/ml ,四環(huan)素(su)(su)(su)(su)10μg/ml ,卡那(nei)霉(mei)素(su)(su)(su)(su)50μg/ml 。
2)加溫除(chu)(chu)菌:支原體(ti)(ti)不(bu)耐熱,可(ke)以對支原體(ti)(ti)污染的(de)(de)細(xi)胞(bao)熱處理除(chu)(chu)菌。因高溫對細(xi)胞(bao)本身(shen)也會(hui)產(chan)生一定影響,故(gu)熱處理前(qian)需先(xian)進行(xing)預(yu)實驗(yan),確(que)定對細(xi)胞(bao)影響zui小而(er)能zui大程度的(de)(de)殺死支原體(ti)(ti)的(de)(de)時間。
4-黑膠(jiao)蟲(chong)
黑(hei)膠(jiao)蟲的(de)存在目(mu)前尚(shang)有爭議,其(qi)在低倍(bei)下為黑(hei)色點狀(zhuang),高倍(bei)下可看見黑(hei)色的(de)小(xiao)蟲游(you)(you)來游(you)(you)去,培養液也是不渾的(de),對細胞(bao)(bao)生長狀(zhuang)態不會(hui)有明顯影(ying)響,在細胞(bao)(bao)增(zeng)殖旺盛之后會(hui)自然(ran)消(xiao)失,除更換(huan)血清外無須特殊處(chu)理。
5-原蟲
培養(yang)液可(ke)輕(qing)微(wei)渾濁,顯微(wei)鏡下(xia)那些細(xi)小的(de)點(dian)狀(zhuang)物(wu)數(shu)(shu)量非常多(duo),輕(qing)微(wei)活(huo)動,細(xi)胞雖然(ran)可(ke)以生(sheng)長(chang)但(dan)繁殖(zhi)速(su)度卻明顯減(jian)慢,而且細(xi)胞狀(zhuang)態不(bu)好,邊緣(yuan)不(bu)清楚,細(xi)胞不(bu)透亮。他們與(yu)細(xi)胞可(ke)共生(sheng)但(dan)會(hui)與(yu)細(xi)胞爭奪營養(yang)。這種(zhong)共生(sheng)是非常普遍的(de),但(dan)他們的(de)數(shu)(shu)量小,細(xi)胞站優勢所以不(bu)會(hui)影響到細(xi)胞的(de)正常生(sheng)長(chang),只有當他們到達一定(ding)的(de)數(shu)(shu)量時就會(hui)影響到細(xi)胞的(de)生(sheng)長(chang),zui終形成惡性循(xun)環(huan)。
6-病毒
組織細(xi)胞(bao)培養(yang)過(guo)程中,如果沒有除去潛在的(de)病(bing)毒,就會產生(sheng)病(bing)毒污染。目前(qian),從原代猴腎細(xi)胞(bao)的(de)培養(yang)中已發(fa)現不少于20種血(xue)清性病(bing)毒。 盡管病(bing)毒污染的(de)細(xi)胞(bao)不影(ying)響原代培養(yang),但生(sheng)產疫(yi)苗是不安全的(de)。因此(ci),潛在病(bing)毒是細(xi)胞(bao)大(da)量生(sheng)產和(he)疫(yi)苗、干擾素等(deng)生(sheng)物(wu)制(zhi)(zhi)品制(zhi)(zhi)作(zuo)中的(de)難題。
7-非同種細胞污染
即細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)交叉(cha)污染,由于細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)養操作時(shi)各細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)株所(suo)需的器材(cai)和溶液(ye)沒有嚴格分開(kai),往往會使(shi)一(yi)種細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)被(bei)另一(yi)種細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)污染。目前,世界上已有幾(ji)十(shi)種細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)都被(bei)HeLa細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)所(suo)污染,致使(shi)許多(duo)實驗宣告(gao)無效。非細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)養物(wu)所(suo)造成的化學成分的污染也偶有發生,大多(duo)是由于細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)養所(suo)需物(wu)品清洗消毒不*而帶入一(yi)些(xie)有毒化學物(wu)質所(suo)致。
污染是(shi)細胞(bao)培養的大敵,預防(fang)和(he)避免污染是(shi)成(cheng)功培養細胞(bao)的關(guan)鍵之一。危機意識要貫徹實驗的始終,否則不僅浪費時間,而且浪費人力、物(wu)力,甚至造成(cheng)無法彌補(bu)的損(sun)失。
(如何預防細(xi)(xi)胞培(pei)養的污(wu)染和清(qing)除(chu)這些污(wu)染物呢?)慧穎 細(xi)(xi)胞庫 技術(shu)為您解答:
一、污染的預防
預防是防止細胞(bao)培養過程中發(fa)(fa)生(sheng)污染(ran)的(de)辦法(fa)。只(zhi)有預防工作做(zuo)在前,才(cai)能將(jiang)發(fa)(fa)生(sheng)污染(ran)的(de)可能性降(jiang)到zui小程度。一般預防可從(cong)以下幾方面著手:
1-從操作者做起(qi)
1操作(zuo)者責任心要強,要細心穩(wen)重,操作(zuo)技(ji)術要熟練(lian)。進無菌(jun)室(shi)前要用肥(fei)皂洗手(shou)或用5%新(xin)潔(jie)爾(er)滅浸泡5分鐘(zhong),按規定(ding)穿隔離衣(yi)。進入后關好門,坐下來盡量少走動。工(gong)作(zuo)開(kai)始要先(xian)用75%酒精棉球擦手(shou)、擦瓶(ping)口(kou)和燒灼(zhuo)瓶(ping)口(kou)。事先(xian)要嚴格檢查器材、溶液和培(pei)養(yang)物,不要把污(wu)(wu)染品(pin)或未經消毒(du)的物品(pin)帶入無菌(jun)室(shi)內,更(geng)不能隨便使用,以免造(zao)成大批污(wu)(wu)染。
2、操(cao)作者動作要(yao)輕,必須在(zai)火焰周圍無(wu)菌(jun)區內打開瓶口,并將(jiang)瓶口轉動燒灼(zhuo)。操(cao)作時盡量(liang)不要(yao)談話(hua),若打噴(pen)嚏或(huo)咳嗽應(ying)轉向背(bei)面。
3、操作時要常更換吸管,切勿一根吸管做到底(di)。一旦發現吸管口(kou)接觸了手和其他污染物品應棄去。實(shi)驗(yan)完畢(bi)及時收拾,保持實(shi)驗(yan)室清潔整(zheng)齊(qi),zui后(hou)用(yong)消毒水浸泡的紗布擦臺面。
2-從(cong)物(wu)品、用品消毒滅(mie)菌著(zhu)手(shou)
細(xi)胞培(pei)養(yang)所用物品清(qing)(qing)洗、消毒(du)要*,各種溶液滅菌除菌要仔細(xi),并在無菌試驗陰(yin)性后才能使用。操作室及(ji)剩余的(de)無菌器材要定期清(qing)(qing)潔消毒(du)滅菌。
3-防止細胞交(jiao)叉污(wu)染
在進(jin)行多種細胞培(pei)養操(cao)(cao)作時(shi),所用器具要嚴格(ge)區分(fen),做上標記(ji)便于辨(bian)別。并按順序進(jin)行操(cao)(cao)作,避免一起進(jin)行時(shi)易發生混亂。
在進行換液或傳代(dai)操作(zuo)時,注射器(qi)和滴管(guan)不要觸及細胞培養瓶瓶口,以免把細胞帶(dai)到培養液中污染(ran)其他細胞。
所有(you)細胞(bao)一旦(dan)購置(zhi),或從(cong)別處引入,或自己建立(li),均應及(ji)早留(liu)種凍(dong)存,一旦(dan)發(fa)生污染可棄之復(fu)蘇,重新培養(yang)。
二、污染的清除
培(pei)養細(xi)(xi)胞(bao)(bao)一(yi)經(jing)污染,多(duo)數(shu)較難處理(li)。如果污染細(xi)(xi)胞(bao)(bao)價(jia)值(zhi)不大,宜棄之;有細(xi)(xi)胞(bao)(bao)株留存的或可購置的,可在尋找原因后*消毒(du)操作室(shi),復蘇(su)或重新(xin)購置細(xi)(xi)胞(bao)(bao),再培(pei)養。若污染細(xi)(xi)胞(bao)(bao)價(jia)值(zhi)較大,又難于重新(xin)得到(dao),可采(cai)取以(yi)下(xia)辦法清除。
1-使(shi)用(yong)抗生素
抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)對(dui)殺(sha)滅細(xi)菌(jun)較有(you)效(xiao)。聯合用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)比(bi)單(dan)獨用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)效(xiao)果(guo)好(hao)。預防(fang)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)比(bi)污染后再(zai)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)效(xiao)果(guo)好(hao)。預防(fang)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)一般(ban)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)雙抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)(青霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)100u/mL加(jia)鏈霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)100μg/mL),污染后清除用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)需采用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)大(da)(da)于(yu)常(chang)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)量5~10倍(bei)的沖洗法(fa),于(yu)加(jia)藥(yao)(yao)后作(zuo)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)24~48小時,再(zai)換常(chang)規培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)。此(ci)法(fa)在污染早期可(ke)能(neng)有(you)效(xiao)。所用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)品(pin)種除青霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)、鏈霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)外,還可(ke)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)慶大(da)(da)霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)、卡那(nei)霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)、多粘菌(jun)素(su)(su)(su)、四(si)環(huan)素(su)(su)(su)、制霉(mei)(mei)菌(jun)素(su)(su)(su)等。常(chang)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)400~800μg/mL卡那(nei)霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)或200μg/mL四(si)環(huan)素(su)(su)(su)處(chu)理,每隔(ge)2~3日(ri)換液(ye)1次(ci),傳1~2代進行治療。近年(nian)來有(you)報道,4-氟,2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳(er)素(su)(su)(su)衍生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四(si)環(huan)素(su)(su)(su)衍生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(BM-2)等三種抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)單(dan)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)或合用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)對(dui)殺(sha)滅支(zhi)原體(ti)有(you)效(xiao)。這(zhe)三種抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(su)均用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)PBS配成(cheng)250濃(nong)縮液(ye),-20℃保(bao)存備用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong),使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)濃(nong)度(du)Cip為10μg/mL,BM-1為10μg/mL,BM-2為5μg/mL。使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)時先吸除污染的培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye),加(jia)入含BM-1的RPMI1640培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye),3天后再(zai)吸除培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye),加(jia)入含BM-2的RPMI1640培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye),培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)4天,如此(ci)連續3個輪次(ci),直至用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)33258熒光染色鏡檢證(zheng)明已(yi)清除支(zhi)原體(ti)后,再(zai)加(jia)正常(chang)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)傳代3-4次(ci)。
2-使用支原體特異性血清
用5%的兔支原體(ti)(ti)免(mian)疫血清(血凝效價(jia)1:320以上(shang))可去除支原體(ti)(ti)污染,因特異抗體(ti)(ti)可抑制支原體(ti)(ti)生長,故經(jing)抗血清處理后11天即(ji)轉(zhuan)為陰(yin)性(xing),并且5個月后仍(reng)為陰(yin)性(xing)。但此法比較(jiao)麻煩,不如用抗生素方便、經(jing)濟。
3-加溫處理
將(jiang)污染的組織培(pei)養(yang)物放(fang)在41℃培(pei)養(yang)18小(xiao)時(shi),可(ke)殺(sha)死支(zhi)原(yuan)體(ti),但對細胞(bao)有不良影響。所以(yi)在處理(li)前要進行(xing)預試驗,摸索(suo)能zui大限度殺(sha)死支(zhi)原(yuan)體(ti)又對細胞(bao)影響zui小(xiao)的加熱時(shi)間。此法(fa)有時(shi)不可(ke)靠(kao)。若先(xian)用藥物處理(li)后,再以(yi)41℃加溫處理(li)效果(guo)更佳。
4-其他方法
除(chu)了上述(shu)去除(chu)污染(ran)的方法(fa)(fa)(fa)外,還有動物體(ti)內接種除(chu)菌法(fa)(fa)(fa)、巨(ju)噬細胞吞噬法(fa)(fa)(fa)、污染(ran)培養(yang)瓶中加(jia)溴尿嘧啶再用光照射(she)的方法(fa)(fa)(fa)及過(guo)濾(lv)法(fa)(fa)(fa)等,但均較麻(ma)煩(fan),且效果(guo)不確定。所(suo)以一旦(dan)支(zhi)原體(ti)污染(ran),除(chu)非有特別(bie)重要(yao)價值,一般均棄之重新培養(yang)。
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牛試劑盒,牛elisa試劑(ji)盒,酶聯免疫試劑(ji)盒
綿羊試劑盒(he),綿羊elisa試(shi)劑盒,酶聯(lian)免疫試(shi)劑盒
馬(ma)試劑盒,馬(ma)elisa試劑盒,酶聯免疫試劑(ji)盒
駱(luo)駝試劑盒,駱(luo)駝(tuo)elisa試劑盒,酶聯(lian)免疫試劑(ji)盒
鹿試劑盒,鹿elisa試劑盒(he),酶聯免疫(yi)試劑盒
雞試劑盒,雞ELISA試劑(ji)盒,酶聯免疫試(shi)劑(ji)盒(he)
猴試(shi)劑(ji)盒(he),猴elisa試劑盒,酶聯免疫試劑盒
小鼠試(shi)劑盒(he),小鼠elisa試(shi)劑盒,酶聯免疫試劑(ji)盒
大鼠試劑(ji)盒,大鼠ELISA試劑盒,酶聯免疫試劑(ji)盒
人(ren)試劑盒(he),人(ren)elisa試劑(ji)盒,酶聯免疫試劑盒
植(zhi)物(wu)病毒、細(xi)菌(jun)、真菌(jun)、植(zhi)物(wu)激(ji)素(su)和轉基因(yin)作物(wu)的農(nong)業診斷試劑盒
動(dong)植物疾病診(zhen)斷類如豬、牛、羊、馬等家畜(chu)和禽類以及寵物類檢測試(shi)劑盒
15596026 TRIzol試劑
15596018 TRIzol試劑
11668027 脂質體2000轉染試劑
11668019 脂(zhi)質體2000轉染試(shi)劑
13778075 RNAiMAX轉染試劑(ji)
17504044 B-27(黃顏色)
12587010 B-27 (黃(huang)顏色(se))不含維生素A
17502048 N-2 (粉紅顏色)
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