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OVK18細胞 OVK18細胞 人卵巢癌細胞(細胞培(pei)養中(zhong)常(chang)見的生物污染(ran)類型有7種,分別(bie)是細菌污染(ran)、支原體污染(ran)、原蟲污染(ran)、黑膠蟲污染(ran)、真菌污染(ran)、病毒污染(ran)以(yi)及(ji)非(fei)細胞污染(ran),那么(me)他們污染(ran)細胞的特點分別(bie)是什么(me)呢?怎(zen)樣能夠減少污染(ran)現(xian)象的發生?)
1-細菌
細菌(jun)污(wu)染(ran)常見(jian)的(de)有大腸桿菌(jun),葡萄球菌(jun)等(deng)。細菌(jun)污(wu)染(ran)較易發現,在普通倒置(zhi)(zhi)顯微鏡下為黑色細沙(sha)狀,培養(yang)(yang)液(ye)一(yi)般會(hui)(hui)在短(duan)時(shi)間內變黃,有時(shi)靜置(zhi)(zhi)的(de)培養(yang)(yang)液(ye)不混(hun),稍(shao)加震蕩會(hui)(hui)有很多(duo)混(hun)濁物漂(piao)起。顯微鏡下可見(jian)培養(yang)(yang)液(ye)中有大量圓球狀顆粒物漂(piao)浮,有時(shi)在細胞表面及周(zhou)圍(wei)有大量細菌(jun)存(cun)在,細胞停止(zhi)生長并有中毒表現。
處理:①在培(pei)養液(ye)中加入相應的抗生素,能夠預防(fang)絕大多數的細(xi)菌污染。
2-真菌
真菌污染(ran)是細胞培(pei)養(yang)(yang)過程中(zhong)zui常(chang)見(jian)(jian)的一種,尤其梅雨(yu)季節(jie)快(kuai)要到了(le),進行細胞培(pei)養(yang)(yang)時更易(yi)污染(ran)。污染(ran)細胞的多為煙曲霉(mei)、黑曲霉(mei)、毛霉(mei)菌、孢子霉(mei)、白念珠菌、酵母菌等。霉(mei)菌污染(ran)后多數在培(pei)養(yang)(yang)液(ye)中(zhong)形成白色或淺黃色漂浮(fu)物。一般肉眼可見(jian)(jian),較(jiao)易(yi)被發現,短期內培(pei)養(yang)(yang)液(ye)多不(bu)混濁,倒置顯微鏡下可見(jian)(jian)于細胞之(zhi)間縱(zong)橫(heng)交錯穿行的絲狀(zhuang)、管狀(zhuang)、及樹枝狀(zhuang)菌絲,并(bing)懸浮(fu)飄蕩在培(pei)養(yang)(yang)液(ye)中(zhong)。
很多菌(jun)(jun)絲(si)在(zai)高倍鏡(jing)可(ke)見到有鏈狀排列的(de)菌(jun)(jun)珠;念珠菌(jun)(jun)或(huo)酵(jiao)母菌(jun)(jun)形(xing)態呈卵(luan)形(xing),散在(zai)細(xi)胞(bao)周邊和細(xi)胞(bao)之間(jian)生長(chang)。鏡(jing)下看時,要將培養瓶(ping)用酒精棉球擦干凈,以防止(zhi)與瓶(ping)外尤其瓶(ping)底外面生長(chang)的(de)菌(jun)(jun)絲(si)相(xiang)混淆。
真菌(jun)(jun)污染(ran)后,細胞(bao)生(sheng)長變慢,但zui后由(you)于(yu)營養耗(hao)盡(jin)及毒性(xing)作用而使細胞(bao)脫落死亡。真菌(jun)(jun)生(sheng)長的比較慢,不象細菌(jun)(jun)那么(me)容易被發現,但是一(yi)旦發現有它的存在細胞(bao)就被污染(ran)了(le)(le),也(ye)很難(nan)救活(huo)了(le)(le)。
3-支原體(ti)
支原(yuan)體的大小(xiao)介(jie)于細菌和病毒之間,是(shi)一種獨立(li)生(sheng)(sheng)(sheng)活的微生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)。對熱敏(min)感(gan),對一般抗(kang)生(sheng)(sheng)(sheng)素不敏(min)感(gan)。支原(yuan)體的形(xing)態多(duo)變,多(duo)吸附(fu)在細胞表面(mian)和細胞之間。電鏡下觀察,中(zhong)心(xin)有(you)高密度的密集顆(ke)粒,橫斷面(mian)與細胞微絨毛相似(si)。
因國內的血清(qing)大多數都沒有(you)做(zuo)支(zhi)(zhi)原(yuan)體陰性檢測,而支(zhi)(zhi)原(yuan)體又是(shi)牛血清(qing)中(zhong)zui常見的微(wei)生(sheng)物之一。支(zhi)(zhi)原(yuan)體污(wu)染(ran)細胞后,培(pei)養液輕微(wei)發生(sheng)混濁.但細胞變化(hua)不顯著,隨著細胞的培(pei)養會慢(man)慢(man)死亡。
支(zhi)(zhi)原(yuan)體污染檢測(熒(ying)光(guang)染色法):DNA和與DNA特異性結(jie)合(he)的(de)熒(ying)光(guang)染料(liao)結(jie)合(he),使得支(zhi)(zhi)原(yuan)體的(de)DNA著色,然后用熒(ying)光(guang)顯微鏡(jing)觀(guan)察。鏡(jing)下支(zhi)(zhi)原(yuan)體為(wei)散(san)在于(yu)細胞同圍或附(fu)于(yu)細胞膜表面的(de)亮綠色小點。
解(jie)決:
1)抗生素(su)排除(chu)法:支原體污(wu)染預防(fang)比解決(jue)好。如果不(bu)小(xiao)心(xin)污(wu)染后,可加(jia)入高濃度抗生素(su)(常(chang)規使(shi)用(yong)的5倍濃度)作用(yong)24-48小(xiao)時(shi),再換入常(chang)規培養(yang)液,但該法不(bu)保證有效(xiao)。推薦用(yong)量:慶大霉(mei)素(su) 200μg/ml ,四環素(su)10μg/ml ,卡(ka)那霉(mei)素(su)50μg/ml 。
2)加溫除(chu)菌(jun):支原體不(bu)耐熱(re),可(ke)以對支原體污(wu)染(ran)的細胞(bao)熱(re)處(chu)理(li)(li)除(chu)菌(jun)。因高溫對細胞(bao)本身也會(hui)產(chan)生一定(ding)影響,故熱(re)處(chu)理(li)(li)前需先進行預實(shi)驗(yan),確定(ding)對細胞(bao)影響zui小而能(neng)zui大(da)程(cheng)度的殺(sha)死支原體的時間。
4-黑膠蟲
黑膠(jiao)蟲的(de)(de)存(cun)在(zai)目前尚有爭議,其在(zai)低倍下(xia)為黑色點狀,高倍下(xia)可(ke)看見(jian)黑色的(de)(de)小蟲游(you)來游(you)去,培養液也是不渾(hun)的(de)(de),對細(xi)胞生長狀態不會(hui)(hui)有明顯影響,在(zai)細(xi)胞增(zeng)殖旺盛(sheng)之后(hou)會(hui)(hui)自然消失,除更換血清外無須(xu)特殊處理。
5-原蟲
培養(yang)液(ye)可輕(qing)微渾濁,顯微鏡下那些細(xi)小的(de)(de)點狀(zhuang)物數量(liang)非(fei)常(chang)多,輕(qing)微活動,細(xi)胞(bao)(bao)(bao)雖(sui)然可以生(sheng)長但(dan)繁殖速(su)度卻(que)明顯減慢,而且細(xi)胞(bao)(bao)(bao)狀(zhuang)態不(bu)(bu)好,邊緣不(bu)(bu)清楚(chu),細(xi)胞(bao)(bao)(bao)不(bu)(bu)透(tou)亮。他們(men)與細(xi)胞(bao)(bao)(bao)可共生(sheng)但(dan)會與細(xi)胞(bao)(bao)(bao)爭奪(duo)營養(yang)。這種共生(sheng)是非(fei)常(chang)普遍(bian)的(de)(de),但(dan)他們(men)的(de)(de)數量(liang)小,細(xi)胞(bao)(bao)(bao)站(zhan)優(you)勢所以不(bu)(bu)會影響(xiang)到(dao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)正常(chang)生(sheng)長,只有當(dang)他們(men)到(dao)達(da)一定的(de)(de)數量(liang)時(shi)就會影響(xiang)到(dao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)生(sheng)長,zui終形成惡(e)性循環(huan)。
6-病毒
組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)培養(yang)過(guo)程中,如果沒有除去潛在的(de)病(bing)毒(du)(du),就會產生病(bing)毒(du)(du)污(wu)染(ran)。目前(qian),從原(yuan)代猴(hou)腎細(xi)胞(bao)的(de)培養(yang)中已發現不少于20種血清(qing)性(xing)病(bing)毒(du)(du)。 盡(jin)管病(bing)毒(du)(du)污(wu)染(ran)的(de)細(xi)胞(bao)不影響原(yuan)代培養(yang),但生產疫苗是(shi)不安全的(de)。因(yin)此,潛在病(bing)毒(du)(du)是(shi)細(xi)胞(bao)大量生產和疫苗、干擾(rao)素等生物制(zhi)品(pin)制(zhi)作中的(de)難題(ti)。
7-非(fei)同種細胞污染
即細胞(bao)(bao)交叉污染(ran),由(you)于細胞(bao)(bao)培養操作時各細胞(bao)(bao)株所(suo)需(xu)的器(qi)材和溶液沒(mei)有(you)(you)嚴格(ge)分(fen)開,往往會使(shi)一種(zhong)細胞(bao)(bao)被另一種(zhong)細胞(bao)(bao)污染(ran)。目前,世(shi)界上(shang)已有(you)(you)幾十(shi)種(zhong)細胞(bao)(bao)都(dou)被HeLa細胞(bao)(bao)所(suo)污染(ran),致使(shi)許多實(shi)驗(yan)宣告(gao)無效。非細胞(bao)(bao)培養物(wu)所(suo)造(zao)成的化(hua)學(xue)成分(fen)的污染(ran)也偶有(you)(you)發生,大(da)多是由(you)于細胞(bao)(bao)培養所(suo)需(xu)物(wu)品清洗消毒(du)不*而帶入一些有(you)(you)毒(du)化(hua)學(xue)物(wu)質所(suo)致。
污染是細胞培(pei)養的(de)大敵,預防和(he)避免(mian)污染是成(cheng)功培(pei)養細胞的(de)關(guan)鍵之一(yi)。危機(ji)意(yi)識要貫徹實驗(yan)的(de)始終,否則(ze)不僅(jin)浪費(fei)時間,而且浪費(fei)人力、物力,甚至造成(cheng)無法彌補的(de)損(sun)失。
HAC-2細胞,人卵巢囊腺癌細胞(如何預防細胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)的污染和清除這些污染物呢?)慧穎 細胞(bao)(bao)庫 技術(shu)為您(nin)解答:
一(yi)、污(wu)染的預(yu)防(fang)
預(yu)防(fang)是防(fang)止細胞培養過程中發生(sheng)污(wu)染的辦法。只(zhi)有預(yu)防(fang)工(gong)作做在前(qian),才能將發生(sheng)污(wu)染的可(ke)(ke)能性降(jiang)到zui小(xiao)程度。一般預(yu)防(fang)可(ke)(ke)從(cong)以(yi)下(xia)幾方面著手:
1-從操作者做起
1操(cao)(cao)作者責任心要(yao)(yao)強,要(yao)(yao)細心穩(wen)重,操(cao)(cao)作技(ji)術(shu)要(yao)(yao)熟練。進無菌(jun)室前(qian)要(yao)(yao)用(yong)肥皂洗(xi)手或用(yong)5%新潔(jie)爾滅浸泡5分鐘,按規(gui)定穿隔離(li)衣。進入后(hou)關好門,坐(zuo)下來盡量少走動(dong)。工(gong)作開始(shi)要(yao)(yao)先用(yong)75%酒精(jing)棉球擦手、擦瓶口(kou)和燒灼瓶口(kou)。事先要(yao)(yao)嚴格檢(jian)查器材、溶(rong)液和培養物,不要(yao)(yao)把(ba)污(wu)染品或未經(jing)消毒的物品帶(dai)入無菌(jun)室內,更不能隨(sui)便使用(yong),以免造成大(da)批污(wu)染。
2、操(cao)作(zuo)者動(dong)作(zuo)要輕,必(bi)須在火焰周圍(wei)無(wu)菌區內打(da)開瓶口(kou),并將瓶口(kou)轉(zhuan)動(dong)燒灼。操(cao)作(zuo)時(shi)盡量(liang)不要談話,若打(da)噴嚏或咳嗽應轉(zhuan)向(xiang)背面。
3、操作(zuo)時要常更換吸管,切(qie)勿(wu)一(yi)根吸管做到底。一(yi)旦發現吸管口(kou)接觸了手和其(qi)他污染物品(pin)應棄(qi)去。實(shi)驗(yan)完畢及時收拾,保持實(shi)驗(yan)室清潔整(zheng)齊(qi),zui后用消毒水浸泡(pao)的紗(sha)布擦臺(tai)面。
2-從物(wu)品、用品消毒滅(mie)菌著手
細胞培養所用物品清洗、消毒(du)要(yao)*,各種溶液滅菌除菌要(yao)仔(zi)細,并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要(yao)定期清潔消毒(du)滅菌。
3-防(fang)止(zhi)細胞交叉污染
在進行(xing)多種細胞培(pei)養操(cao)作時,所(suo)用(yong)器具要嚴格區分,做上標記便(bian)于辨(bian)別。并按(an)順序進行(xing)操(cao)作,避免一起進行(xing)時易發生混亂。
在進行換液或傳代(dai)操作時,注射器和滴(di)管不要觸及(ji)細(xi)胞(bao)培養瓶(ping)瓶(ping)口,以免把細(xi)胞(bao)帶到培養液中污染其他(ta)細(xi)胞(bao)。
所有細胞一旦購置,或從別處(chu)引入,或自己建立,均(jun)應及早留種凍存(cun),一旦發(fa)生污染可(ke)棄之復蘇,重新培養。
二、污染的清(qing)除(chu)
培(pei)養(yang)(yang)細(xi)(xi)胞一經(jing)污(wu)染(ran)(ran),多數較難處理。如果污(wu)染(ran)(ran)細(xi)(xi)胞價(jia)值(zhi)不大(da),宜棄(qi)之;有(you)細(xi)(xi)胞株留存的或可(ke)購置的,可(ke)在尋(xun)找(zhao)原(yuan)因后(hou)*消(xiao)毒操作室,復(fu)蘇或重(zhong)新(xin)購置細(xi)(xi)胞,再培(pei)養(yang)(yang)。若污(wu)染(ran)(ran)細(xi)(xi)胞價(jia)值(zhi)較大(da),又難于(yu)重(zhong)新(xin)得到,可(ke)采取以下辦法(fa)清(qing)除(chu)。
1-使用抗生素
抗(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)對殺滅細菌較有(you)(you)效(xiao)(xiao)。聯合(he)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥比(bi)單(dan)獨用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥效(xiao)(xiao)果(guo)好。預防用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥比(bi)污(wu)染(ran)(ran)后再用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥效(xiao)(xiao)果(guo)好。預防用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥一般用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)雙(shuang)抗(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)(青(qing)霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)100u/mL加(jia)鏈霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)100μg/mL),污(wu)染(ran)(ran)后清(qing)除用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥需采用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)大(da)于(yu)常(chang)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)量5~10倍的沖洗法(fa),于(yu)加(jia)藥后作用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)24~48小時(shi),再換常(chang)規培(pei)(pei)養(yang)液(ye)(ye)(ye)。此法(fa)在污(wu)染(ran)(ran)早期可能有(you)(you)效(xiao)(xiao)。所(suo)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)抗(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)品種除青(qing)霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)、鏈霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)外,還可用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)慶大(da)霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)、卡那霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)、多粘菌素(su)(su)(su)、四(si)(si)環素(su)(su)(su)、制霉(mei)(mei)菌素(su)(su)(su)等。常(chang)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)400~800μg/mL卡那霉(mei)(mei)素(su)(su)(su)或200μg/mL四(si)(si)環素(su)(su)(su)處理,每隔2~3日(ri)換液(ye)(ye)(ye)1次(ci)(ci),傳1~2代(dai)進行治療。近(jin)年來(lai)有(you)(you)報道(dao),4-氟,2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳(er)素(su)(su)(su)衍生(sheng)物(wu)(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和(he)四(si)(si)環素(su)(su)(su)衍生(sheng)物(wu)(BM-2)等三種抗(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)單(dan)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)或合(he)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)對殺滅支原體(ti)有(you)(you)效(xiao)(xiao)。這三種抗(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)均用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)PBS配(pei)成250濃縮液(ye)(ye)(ye),-20℃保(bao)存備用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong),使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)濃度(du)Cip為10μg/mL,BM-1為10μg/mL,BM-2為5μg/mL。使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)時(shi)先吸除污(wu)染(ran)(ran)的培(pei)(pei)養(yang)液(ye)(ye)(ye),加(jia)入(ru)含BM-1的RPMI1640培(pei)(pei)養(yang)液(ye)(ye)(ye),3天后再吸除培(pei)(pei)養(yang)液(ye)(ye)(ye),加(jia)入(ru)含BM-2的RPMI1640培(pei)(pei)養(yang)液(ye)(ye)(ye),培(pei)(pei)養(yang)4天,如此連續3個(ge)輪次(ci)(ci),直至用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)33258熒光(guang)染(ran)(ran)色鏡檢證明已清(qing)除支原體(ti)后,再加(jia)正(zheng)常(chang)培(pei)(pei)養(yang)液(ye)(ye)(ye)培(pei)(pei)養(yang)傳代(dai)3-4次(ci)(ci)。
2-使(shi)用支(zhi)原體(ti)特異性血清
用(yong)5%的兔(tu)支(zhi)原(yuan)體(ti)免疫血清(血凝效價1:320以上)可(ke)去除支(zhi)原(yuan)體(ti)污染,因特異抗(kang)體(ti)可(ke)抑制(zhi)支(zhi)原(yuan)體(ti)生長,故(gu)經抗(kang)血清處理后(hou)11天即轉為陰性(xing),并(bing)且5個(ge)月后(hou)仍為陰性(xing)。但此法比較麻(ma)煩,不如用(yong)抗(kang)生素方便(bian)、經濟。
3-加(jia)溫(wen)處(chu)理
將污(wu)染(ran)的組織(zhi)培養(yang)物(wu)放在41℃培養(yang)18小時,可殺死支(zhi)原體,但對細胞有不良影響(xiang)。所以(yi)在處理(li)前(qian)要進(jin)行(xing)預試驗,摸(mo)索能(neng)zui大限度殺死支(zhi)原體又對細胞影響(xiang)zui小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥(yao)物(wu)處理(li)后(hou),再以(yi)41℃加溫處理(li)效果更佳。
4-其(qi)他方法(fa)
除了(le)上述去除污(wu)染的方法外,還有(you)動物體內接種除菌法、巨噬細胞(bao)吞噬法、污(wu)染培養(yang)瓶中(zhong)加溴(xiu)尿嘧啶再(zai)用光照射的方法及過(guo)濾法等,但(dan)均較麻煩,且效(xiao)果不確定。所以一(yi)旦支原體污(wu)染,除非(fei)有(you)特別重要價值,一(yi)般均棄之(zhi)重新培養(yang)。
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人試劑盒,人elisa試劑盒(he),酶(mei)聯(lian)免(mian)疫試劑盒
植物(wu)病(bing)毒(du)、細(xi)菌、真菌、植物(wu)激素(su)和轉基因作物(wu)的農業診(zhen)斷試劑盒
動植物(wu)疾(ji)病診斷類如(ru)豬(zhu)、牛、羊(yang)、馬等家畜和禽類以及寵(chong)物(wu)類檢測試劑盒
15596026 TRIzol試劑(ji)
15596018 TRIzol試劑
11668027 脂質(zhi)體2000轉染試劑(ji)
11668019 脂質體2000轉染試(shi)劑(ji)
13778075 RNAiMAX轉染試劑
17504044 B-27(黃(huang)顏(yan)色)
12587010 B-27 (黃顏色(se))不含維生素(su)A
17502048 N-2 (粉紅(hong)顏色)