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1-細菌
細菌(jun)污(wu)染(ran)常見的有(you)(you)(you)大(da)腸桿菌(jun),葡萄球菌(jun)等。細菌(jun)污(wu)染(ran)較易發現(xian),在(zai)普通倒(dao)置(zhi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)下為黑色細沙(sha)狀,培(pei)(pei)養液(ye)一般會在(zai)短(duan)時間內變黃,有(you)(you)(you)時靜(jing)置(zhi)的培(pei)(pei)養液(ye)不(bu)混,稍加震蕩會有(you)(you)(you)很多混濁物漂(piao)起。顯(xian)微(wei)鏡(jing)下可見培(pei)(pei)養液(ye)中有(you)(you)(you)大(da)量圓球狀顆粒物漂(piao)浮(fu),有(you)(you)(you)時在(zai)細胞表面及周圍有(you)(you)(you)大(da)量細菌(jun)存在(zai),細胞停(ting)止生(sheng)長并(bing)有(you)(you)(you)中毒表現(xian)。
處理:①在(zai)培養液中加入相應的抗生素(su),能夠預(yu)防絕大多(duo)數的細菌(jun)污(wu)染。
2-真菌
真(zhen)菌污(wu)染(ran)是(shi)細胞(bao)培(pei)養(yang)過程中(zhong)zui常見的一(yi)種,尤其梅雨季節快要(yao)到(dao)了(le),進行細胞(bao)培(pei)養(yang)時更易(yi)污(wu)染(ran)。污(wu)染(ran)細胞(bao)的多(duo)為煙曲霉(mei)、黑曲霉(mei)、毛霉(mei)菌、孢子(zi)霉(mei)、白(bai)念珠(zhu)菌、酵母菌等。霉(mei)菌污(wu)染(ran)后(hou)多(duo)數在(zai)培(pei)養(yang)液中(zhong)形成白(bai)色(se)或淺黃(huang)色(se)漂浮物。一(yi)般肉眼可(ke)見,較易(yi)被發現,短(duan)期(qi)內培(pei)養(yang)液多(duo)不混(hun)濁,倒置顯(xian)微(wei)鏡下可(ke)見于細胞(bao)之間縱橫(heng)交錯(cuo)穿行的絲狀、管狀、及(ji)樹枝狀菌絲,并懸浮飄蕩在(zai)培(pei)養(yang)液中(zhong)。
很多菌(jun)絲(si)在高(gao)倍鏡(jing)可見(jian)到有鏈狀排列的菌(jun)珠;念(nian)珠菌(jun)或酵母菌(jun)形態呈卵形,散在細胞周(zhou)邊和細胞之間生長(chang)。鏡(jing)下看時,要將(jiang)培養瓶(ping)用酒精棉球擦干(gan)凈,以防(fang)止(zhi)與瓶(ping)外(wai)尤其瓶(ping)底(di)外(wai)面生長(chang)的菌(jun)絲(si)相混淆。
真菌污染后,細胞生(sheng)長(chang)變慢(man)(man),但zui后由于(yu)營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。真菌生(sheng)長(chang)的比較慢(man)(man),不(bu)象細菌那么容易(yi)被發現,但是一(yi)旦(dan)發現有它的存在細胞就被污染了(le),也很難(nan)救活了(le)。
3-支原體
支原體(ti)(ti)的(de)大小(xiao)介(jie)于(yu)細菌(jun)和病毒之(zhi)間(jian),是(shi)一種獨立生(sheng)活的(de)微(wei)生(sheng)物。對熱敏感,對一般抗(kang)生(sheng)素(su)不(bu)敏感。支原體(ti)(ti)的(de)形(xing)態多變,多吸附(fu)在細胞表面和細胞之(zhi)間(jian)。電鏡下(xia)觀(guan)察,中(zhong)心有高密度的(de)密集顆粒,橫斷面與細胞微(wei)絨(rong)毛相似。
因(yin)國(guo)內的血(xue)清大多數(shu)都沒有(you)做支原體陰性檢測,而(er)支原體又是牛血(xue)清中zui常見的微生(sheng)物之一(yi)。支原體污染細(xi)胞(bao)(bao)后,培(pei)養液輕微發(fa)生(sheng)混(hun)濁.但細(xi)胞(bao)(bao)變化(hua)不顯著,隨著細(xi)胞(bao)(bao)的培(pei)養會慢(man)慢(man)死亡。
支(zhi)原體(ti)(ti)污染檢測(熒(ying)光染色法):DNA和與DNA特異性結(jie)合的熒(ying)光染料結(jie)合,使(shi)得支(zhi)原體(ti)(ti)的DNA著(zhu)色,然后用熒(ying)光顯微(wei)鏡觀察。鏡下支(zhi)原體(ti)(ti)為散在于(yu)細胞同(tong)圍(wei)或附于(yu)細胞膜(mo)表面的亮綠色小(xiao)點(dian)。
解(jie)決:
1)抗(kang)(kang)生素(su)排(pai)除(chu)法:支(zhi)原體(ti)污(wu)染(ran)預防比解(jie)決好(hao)。如果不小心污(wu)染(ran)后,可加入高(gao)濃度(du)抗(kang)(kang)生素(su)(常規使用(yong)的5倍濃度(du))作用(yong)24-48小時,再換入常規培養(yang)液,但該(gai)法不保證有(you)效。推薦用(yong)量:慶大霉素(su) 200μg/ml ,四環素(su)10μg/ml ,卡那(nei)霉素(su)50μg/ml 。
2)加溫除(chu)菌:支原體不耐熱,可(ke)以對(dui)支原體污(wu)染的細胞熱處(chu)理除(chu)菌。因高(gao)溫對(dui)細胞本身也(ye)會產生一定(ding)影(ying)響(xiang),故熱處(chu)理前需先進(jin)行預實驗(yan),確(que)定(ding)對(dui)細胞影(ying)響(xiang)zui小而能(neng)zui大(da)程度的殺(sha)死支原體的時間。
4-黑膠蟲
黑膠蟲的存(cun)在目前尚(shang)有爭議,其在低倍(bei)下為黑色點狀(zhuang),高(gao)倍(bei)下可(ke)看見(jian)黑色的小蟲游來游去,培養(yang)液也是不(bu)渾的,對細(xi)胞(bao)生長狀(zhuang)態不(bu)會有明顯影響(xiang),在細(xi)胞(bao)增殖旺盛之(zhi)后(hou)會自然(ran)消失,除更換血清外(wai)無須(xu)特殊處(chu)理。
5-原(yuan)蟲
培養液可輕(qing)微渾濁,顯微鏡下(xia)那些細小的點狀物數量(liang)非常(chang)多,輕(qing)微活動(dong),細胞(bao)(bao)雖(sui)然可以生長(chang)但繁殖速度卻明顯減慢(man),而且細胞(bao)(bao)狀態不(bu)好(hao),邊緣不(bu)清楚(chu),細胞(bao)(bao)不(bu)透亮(liang)。他(ta)們與(yu)細胞(bao)(bao)可共(gong)生但會與(yu)細胞(bao)(bao)爭奪(duo)營養。這(zhe)種共(gong)生是非常(chang)普(pu)遍的,但他(ta)們的數量(liang)小,細胞(bao)(bao)站優勢所以不(bu)會影響(xiang)到細胞(bao)(bao)的正常(chang)生長(chang),只(zhi)有當(dang)他(ta)們到達一定的數量(liang)時就會影響(xiang)到細胞(bao)(bao)的生長(chang),zui終(zhong)形成惡性(xing)循環。
6-病毒
組織細胞(bao)培(pei)養過(guo)程(cheng)中,如果(guo)沒有(you)除去潛在(zai)的(de)病(bing)(bing)毒(du),就會產生(sheng)病(bing)(bing)毒(du)污(wu)染(ran)。目前,從原代猴(hou)腎細胞(bao)的(de)培(pei)養中已(yi)發現不少于20種血清性(xing)病(bing)(bing)毒(du)。 盡管病(bing)(bing)毒(du)污(wu)染(ran)的(de)細胞(bao)不影響(xiang)原代培(pei)養,但生(sheng)產疫(yi)苗是不安全的(de)。因此,潛在(zai)病(bing)(bing)毒(du)是細胞(bao)大量生(sheng)產和(he)疫(yi)苗、干擾(rao)素(su)等生(sheng)物(wu)制品制作中的(de)難(nan)題(ti)。
7-非同種細胞(bao)污染
即(ji)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)交叉(cha)污(wu)染,由(you)于(yu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)培(pei)養操作時(shi)各細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)株(zhu)所(suo)需的(de)器材和溶液沒有(you)嚴格分(fen)開,往往會(hui)使一種(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)被另一種(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)污(wu)染。目前(qian),世界上已有(you)幾十種(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)都被HeLa細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)所(suo)污(wu)染,致(zhi)使許多實驗(yan)宣告無效。非細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)培(pei)養物(wu)(wu)所(suo)造成的(de)化(hua)學(xue)成分(fen)的(de)污(wu)染也(ye)偶(ou)有(you)發生,大(da)多是(shi)由(you)于(yu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)培(pei)養所(suo)需物(wu)(wu)品清洗消毒不*而帶入一些(xie)有(you)毒化(hua)學(xue)物(wu)(wu)質所(suo)致(zhi)。
污染是細胞(bao)(bao)培(pei)養的大敵,預防和避免污染是成功培(pei)養細胞(bao)(bao)的關鍵之一。危機意(yi)識要貫徹實驗(yan)的始終,否則不(bu)僅(jin)浪(lang)(lang)費時間,而且(qie)浪(lang)(lang)費人力(li)、物(wu)力(li),甚至造成無法彌補的損(sun)失。
(如何預防細胞培養的污染(ran)(ran)和清除這些污染(ran)(ran)物呢?)慧(hui)穎 細胞庫 技術為您(nin)解答(da):
一(yi)、污染的預防
預防(fang)(fang)是(shi)防(fang)(fang)止(zhi)細胞培養過程中發生污染(ran)的辦法。只有預防(fang)(fang)工作做在前(qian),才(cai)能將發生污染(ran)的可能性降(jiang)到zui小程度。一般預防(fang)(fang)可從(cong)以(yi)下幾方面著手:
1-從操作者(zhe)做起(qi)
1操(cao)作(zuo)者責任心要(yao)(yao)(yao)(yao)強,要(yao)(yao)(yao)(yao)細心穩重,操(cao)作(zuo)技術(shu)要(yao)(yao)(yao)(yao)熟(shu)練(lian)。進無菌室前要(yao)(yao)(yao)(yao)用(yong)肥皂洗手(shou)或用(yong)5%新潔爾滅浸泡5分鐘,按規定穿隔離衣(yi)。進入后關好門(men),坐下來(lai)盡量少(shao)走動(dong)。工(gong)作(zuo)開始要(yao)(yao)(yao)(yao)先(xian)用(yong)75%酒精(jing)棉(mian)球擦手(shou)、擦瓶口和(he)燒灼(zhuo)瓶口。事先(xian)要(yao)(yao)(yao)(yao)嚴格(ge)檢查器材、溶液和(he)培養物,不要(yao)(yao)(yao)(yao)把污染品或未經消(xiao)毒的物品帶入無菌室內,更不能隨便使用(yong),以免造(zao)成大批污染。
2、操作(zuo)者動作(zuo)要輕,必須在火焰周圍(wei)無菌區內打開瓶(ping)(ping)口,并(bing)將瓶(ping)(ping)口轉動燒灼(zhuo)。操作(zuo)時盡(jin)量(liang)不要談話(hua),若打噴嚏或咳嗽應(ying)轉向背面。
3、操作時(shi)要常(chang)更換吸(xi)管(guan),切(qie)勿一根吸(xi)管(guan)做到(dao)底。一旦發現吸(xi)管(guan)口(kou)接觸了手和(he)其(qi)他污染物品應棄去(qu)。實(shi)驗(yan)完畢及時(shi)收拾,保持實(shi)驗(yan)室清潔整(zheng)齊,zui后用(yong)消毒水(shui)浸(jin)泡的紗布(bu)擦(ca)臺面。
2-從物品(pin)、用品(pin)消毒(du)滅菌著(zhu)手
細(xi)胞培養所用物品清洗(xi)、消(xiao)毒(du)要*,各種(zhong)溶液滅(mie)菌(jun)除菌(jun)要仔細(xi),并在(zai)無菌(jun)試(shi)驗陰(yin)性(xing)后才能使用。操作室及剩余的無菌(jun)器材要定期清潔消(xiao)毒(du)滅(mie)菌(jun)。
3-防(fang)止細(xi)胞交叉污染
在進行(xing)多種(zhong)細胞培養操(cao)作(zuo)時(shi),所用器具(ju)要嚴格區分,做上標記便(bian)于(yu)辨別(bie)。并(bing)按順(shun)序進行(xing)操(cao)作(zuo),避免一起(qi)進行(xing)時(shi)易(yi)發生混亂(luan)。
在(zai)進行換液(ye)或傳代(dai)操作時,注射(she)器(qi)和滴(di)管不要觸(chu)及細胞(bao)培養瓶(ping)瓶(ping)口,以免把細胞(bao)帶(dai)到培養液(ye)中污(wu)染其他(ta)細胞(bao)。
所有細(xi)胞一(yi)旦(dan)(dan)購(gou)置,或(huo)從別處引(yin)入,或(huo)自己建立,均應及(ji)早留種凍存,一(yi)旦(dan)(dan)發生污染可棄之復蘇(su),重新培(pei)養。
二、污染的清除
培(pei)養細(xi)胞(bao)(bao)一經污(wu)染,多數較難處理。如果(guo)污(wu)染細(xi)胞(bao)(bao)價值(zhi)不大,宜棄之;有細(xi)胞(bao)(bao)株留存的或可(ke)購置(zhi)的,可(ke)在尋找(zhao)原因后*消毒操作(zuo)室,復蘇(su)或重(zhong)新(xin)購置(zhi)細(xi)胞(bao)(bao),再培(pei)養。若(ruo)污(wu)染細(xi)胞(bao)(bao)價值(zhi)較大,又難于重(zhong)新(xin)得到,可(ke)采取(qu)以(yi)下辦(ban)法清除。
1-使(shi)用抗生素
抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)對(dui)(dui)殺滅(mie)細菌(jun)(jun)較有效(xiao)。聯合(he)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)比單獨用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)效(xiao)果好。預(yu)防用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)比污染(ran)后(hou)再(zai)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)效(xiao)果好。預(yu)防用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)一般用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)雙抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)(青霉(mei)(mei)素(su)(su)100u/mL加鏈(lian)霉(mei)(mei)素(su)(su)100μg/mL),污染(ran)后(hou)清(qing)除(chu)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)需采用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)大于(yu)常用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)量5~10倍的(de)(de)沖洗法,于(yu)加藥(yao)(yao)后(hou)作用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)24~48小時(shi),再(zai)換(huan)常規培(pei)養(yang)液。此法在污染(ran)早(zao)期(qi)可能有效(xiao)。所用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)品種除(chu)青霉(mei)(mei)素(su)(su)、鏈(lian)霉(mei)(mei)素(su)(su)外,還可用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)慶大霉(mei)(mei)素(su)(su)、卡那霉(mei)(mei)素(su)(su)、多粘(zhan)菌(jun)(jun)素(su)(su)、四環素(su)(su)、制霉(mei)(mei)菌(jun)(jun)素(su)(su)等(deng)。常用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)400~800μg/mL卡那霉(mei)(mei)素(su)(su)或200μg/mL四環素(su)(su)處理,每隔2~3日(ri)換(huan)液1次(ci),傳1~2代進行治療。近(jin)年來(lai)有報道,4-氟,2-羥基喹(kui)啉(Ciprofloxacin,Cip)、截(jie)耳素(su)(su)衍(yan)生(sheng)(sheng)(sheng)物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環素(su)(su)衍(yan)生(sheng)(sheng)(sheng)物(BM-2)等(deng)三(san)種抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)單用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)或合(he)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)對(dui)(dui)殺滅(mie)支原(yuan)(yuan)體有效(xiao)。這三(san)種抗生(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)均用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)PBS配成250濃縮液,-20℃保存(cun)備用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong),使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)濃度(du)Cip為(wei)10μg/mL,BM-1為(wei)10μg/mL,BM-2為(wei)5μg/mL。使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)時(shi)先(xian)吸(xi)除(chu)污染(ran)的(de)(de)培(pei)養(yang)液,加入(ru)含BM-1的(de)(de)RPMI1640培(pei)養(yang)液,3天后(hou)再(zai)吸(xi)除(chu)培(pei)養(yang)液,加入(ru)含BM-2的(de)(de)RPMI1640培(pei)養(yang)液,培(pei)養(yang)4天,如此連續3個輪(lun)次(ci),直至用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)33258熒光染(ran)色鏡檢證明已清(qing)除(chu)支原(yuan)(yuan)體后(hou),再(zai)加正常培(pei)養(yang)液培(pei)養(yang)傳代3-4次(ci)。
2-使用支原體特異性血清
用5%的兔(tu)支(zhi)原(yuan)體(ti)(ti)免疫(yi)血清(qing)(血凝效價1:320以上)可去除支(zhi)原(yuan)體(ti)(ti)污染,因特異抗(kang)體(ti)(ti)可抑制支(zhi)原(yuan)體(ti)(ti)生長,故經抗(kang)血清(qing)處理后(hou)(hou)11天(tian)即轉為(wei)(wei)陰性(xing),并且5個(ge)月(yue)后(hou)(hou)仍為(wei)(wei)陰性(xing)。但(dan)此法比較(jiao)麻煩,不如用抗(kang)生素方便、經濟(ji)。
3-加(jia)溫處理(li)
將污染的(de)組織(zhi)培養(yang)(yang)物(wu)放在41℃培養(yang)(yang)18小時,可(ke)殺死支原體,但對(dui)細胞有(you)不(bu)良影響。所以在處理前要進行預試驗,摸(mo)索(suo)能zui大限度殺死支原體又對(dui)細胞影響zui小的(de)加(jia)熱時間(jian)。此法有(you)時不(bu)可(ke)靠。若先用藥物(wu)處理后,再以41℃加(jia)溫處理效果更佳。
4-其(qi)他方法
除(chu)了上(shang)述去除(chu)污染的(de)方法(fa)外(wai),還有動物(wu)體(ti)內接(jie)種除(chu)菌法(fa)、巨噬細胞吞(tun)噬法(fa)、污染培(pei)養(yang)瓶中(zhong)加(jia)溴尿嘧(mi)啶再用光照射(she)的(de)方法(fa)及(ji)過濾法(fa)等,但均較(jiao)麻煩,且效果不確定。所以一旦支原體(ti)污染,除(chu)非(fei)有特別重要價值,一般均棄之重新(xin)培(pei)養(yang)。
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鹿(lu)試(shi)劑盒,鹿elisa試劑盒,酶聯(lian)免(mian)疫試劑(ji)盒(he)
雞(ji)試劑(ji)盒,雞ELISA試(shi)劑盒,酶聯(lian)免疫試劑盒
猴試劑盒,猴(hou)elisa試劑盒,酶(mei)聯免疫試劑盒
小鼠試(shi)劑盒,小鼠elisa試劑盒(he),酶(mei)聯免疫(yi)試(shi)劑盒
大(da)鼠試(shi)劑盒,大鼠ELISA試劑盒(he),酶聯免疫試劑盒(he)
人(ren)試劑盒,人(ren)elisa試劑(ji)盒,酶(mei)聯免疫試劑(ji)盒
植(zhi)物(wu)病毒、細菌(jun)(jun)、真菌(jun)(jun)、植(zhi)物(wu)激素和(he)轉基因作(zuo)物(wu)的農業診斷試(shi)劑盒
動植物疾病(bing)診斷類如豬、牛、羊、馬等家畜和禽(qin)類以及寵物類檢測試劑盒
15596026 TRIzol試劑
15596018 TRIzol試劑
11668027 脂質(zhi)體2000轉染試劑(ji)
11668019 脂(zhi)質體2000轉染試(shi)劑
13778075 RNAiMAX轉染試劑
17504044 B-27(黃顏(yan)色)
12587010 B-27 (黃顏色)不(bu)含維生(sheng)素(su)A
17502048 N-2 (粉紅顏色)