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1-細菌
細菌污(wu)染(ran)常見的有(you)(you)大腸(chang)桿菌,葡萄球菌等。細菌污(wu)染(ran)較易發現,在(zai)普通倒(dao)置顯(xian)微鏡下(xia)為黑色細沙(sha)狀,培(pei)(pei)養(yang)(yang)液一般會在(zai)短時(shi)間(jian)內變黃(huang),有(you)(you)時(shi)靜置的培(pei)(pei)養(yang)(yang)液不混,稍加(jia)震蕩會有(you)(you)很多混濁(zhuo)物(wu)漂(piao)起。顯(xian)微鏡下(xia)可見培(pei)(pei)養(yang)(yang)液中有(you)(you)大量(liang)圓球狀顆粒物(wu)漂(piao)浮,有(you)(you)時(shi)在(zai)細胞(bao)表(biao)面及周圍有(you)(you)大量(liang)細菌存(cun)在(zai),細胞(bao)停(ting)止生長并有(you)(you)中毒表(biao)現。
處理:①在(zai)培養(yang)液中加入相應的抗生素,能夠預防(fang)絕大多數的細菌污(wu)染。
2-真菌
真菌污(wu)染(ran)是(shi)細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養(yang)過程(cheng)中zui常(chang)見(jian)(jian)的(de)一種(zhong),尤其梅雨季(ji)節快要(yao)到了,進行(xing)細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養(yang)時更易污(wu)染(ran)。污(wu)染(ran)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)多(duo)為煙曲(qu)霉、黑曲(qu)霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠(zhu)菌、酵(jiao)母菌等。霉菌污(wu)染(ran)后多(duo)數在培(pei)(pei)養(yang)液中形成(cheng)白色或淺(qian)黃色漂浮物。一般肉眼(yan)可見(jian)(jian),較易被發現,短期內培(pei)(pei)養(yang)液多(duo)不混濁,倒置(zhi)顯微鏡下可見(jian)(jian)于細(xi)(xi)胞(bao)之(zhi)間(jian)縱橫交錯穿(chuan)行(xing)的(de)絲狀(zhuang)、管狀(zhuang)、及(ji)樹枝狀(zhuang)菌絲,并(bing)懸浮飄蕩(dang)在培(pei)(pei)養(yang)液中。
很多菌(jun)絲在高倍鏡可見到(dao)有鏈狀(zhuang)排列的菌(jun)珠;念(nian)珠菌(jun)或酵母菌(jun)形態呈卵形,散在細(xi)胞周邊和(he)細(xi)胞之間生(sheng)長(chang)。鏡下看時(shi),要將培養瓶用酒(jiu)精棉球擦干凈,以防止與瓶外尤其瓶底外面生(sheng)長(chang)的菌(jun)絲相混(hun)淆。
真(zhen)菌污染后,細(xi)胞(bao)生(sheng)長變慢,但zui后由于營養耗盡及毒(du)性作用(yong)而使細(xi)胞(bao)脫(tuo)落(luo)死亡。真(zhen)菌生(sheng)長的比(bi)較(jiao)慢,不象細(xi)菌那么容易被發現(xian),但是一(yi)旦發現(xian)有它的存在細(xi)胞(bao)就被污染了(le),也很難救(jiu)活了(le)。
3-支(zhi)原體(ti)
支原體(ti)的(de)大(da)小介于細(xi)(xi)(xi)菌和病(bing)毒之間,是一種獨立生(sheng)活的(de)微生(sheng)物(wu)。對(dui)熱敏感(gan),對(dui)一般抗生(sheng)素不敏感(gan)。支原體(ti)的(de)形態(tai)多(duo)變,多(duo)吸(xi)附(fu)在細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)表面(mian)和細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)之間。電鏡(jing)下觀察,中心有高密(mi)度的(de)密(mi)集顆粒(li),橫(heng)斷面(mian)與細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)微絨(rong)毛相似。
因國內(nei)的血清大多數都沒有做支原體(ti)陰性檢測,而支原體(ti)又是牛血清中zui常見(jian)的微(wei)(wei)生物之一。支原體(ti)污染細(xi)(xi)胞后,培養液輕(qing)微(wei)(wei)發生混濁.但細(xi)(xi)胞變化不(bu)顯(xian)著,隨著細(xi)(xi)胞的培養會慢(man)慢(man)死亡。
支(zhi)原體污染(ran)檢(jian)測(ce)(熒光染(ran)色(se)(se)法):DNA和與DNA特異性結合的(de)(de)(de)熒光染(ran)料結合,使(shi)得支(zhi)原體的(de)(de)(de)DNA著(zhu)色(se)(se),然后(hou)用熒光顯微鏡(jing)觀察。鏡(jing)下(xia)支(zhi)原體為散在(zai)于細(xi)胞(bao)(bao)同圍或(huo)附(fu)于細(xi)胞(bao)(bao)膜表面的(de)(de)(de)亮(liang)綠色(se)(se)小(xiao)點。
解決:
1)抗生素排除法(fa):支原體污染預(yu)防比解決(jue)好。如果不(bu)小(xiao)心污染后(hou),可加入高濃(nong)度抗生素(常規(gui)使(shi)用的5倍濃(nong)度)作用24-48小(xiao)時,再換入常規(gui)培養液,但(dan)該法(fa)不(bu)保證有(you)效。推(tui)薦用量:慶大霉(mei)素 200μg/ml ,四環素10μg/ml ,卡那(nei)霉(mei)素50μg/ml 。
2)加溫(wen)除菌(jun):支(zhi)原體不耐(nai)熱(re)(re)(re),可(ke)以對(dui)(dui)支(zhi)原體污(wu)染(ran)的(de)細(xi)胞(bao)熱(re)(re)(re)處理除菌(jun)。因高溫(wen)對(dui)(dui)細(xi)胞(bao)本身(shen)也會產(chan)生一定影響,故熱(re)(re)(re)處理前需先進行預(yu)實驗,確定對(dui)(dui)細(xi)胞(bao)影響zui小(xiao)而能zui大程度(du)的(de)殺死(si)支(zhi)原體的(de)時(shi)間。
4-黑膠蟲
黑(hei)膠蟲(chong)(chong)的(de)(de)存在(zai)目前尚有爭議(yi),其在(zai)低(di)倍下為(wei)黑(hei)色點狀,高倍下可看(kan)見黑(hei)色的(de)(de)小(xiao)蟲(chong)(chong)游來游去,培養(yang)液也(ye)是不(bu)(bu)渾(hun)的(de)(de),對(dui)細胞生長狀態(tai)不(bu)(bu)會(hui)有明顯影響,在(zai)細胞增殖旺盛之(zhi)后(hou)會(hui)自(zi)然消失,除更(geng)換血清外(wai)無須(xu)特殊處理。
5-原(yuan)蟲
培養(yang)液可(ke)輕(qing)微渾濁,顯微鏡下那些細(xi)(xi)小的(de)點狀物數量(liang)(liang)非常多,輕(qing)微活動,細(xi)(xi)胞(bao)雖然可(ke)以生(sheng)(sheng)長但(dan)(dan)(dan)繁殖(zhi)速(su)度卻明顯減(jian)慢,而且細(xi)(xi)胞(bao)狀態不(bu)好(hao),邊緣不(bu)清楚,細(xi)(xi)胞(bao)不(bu)透亮。他(ta)們與(yu)細(xi)(xi)胞(bao)可(ke)共生(sheng)(sheng)但(dan)(dan)(dan)會(hui)與(yu)細(xi)(xi)胞(bao)爭奪營養(yang)。這種(zhong)共生(sheng)(sheng)是非常普遍的(de),但(dan)(dan)(dan)他(ta)們的(de)數量(liang)(liang)小,細(xi)(xi)胞(bao)站優勢所以不(bu)會(hui)影(ying)響到細(xi)(xi)胞(bao)的(de)正常生(sheng)(sheng)長,只有當他(ta)們到達一定的(de)數量(liang)(liang)時就(jiu)會(hui)影(ying)響到細(xi)(xi)胞(bao)的(de)生(sheng)(sheng)長,zui終形(xing)成惡性(xing)循環。
6-病毒(du)
組(zu)織細(xi)胞培(pei)養過(guo)程中,如(ru)果沒(mei)有除去(qu)潛(qian)在的(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒,就會產生(sheng)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒污染。目前,從(cong)原(yuan)(yuan)代猴(hou)腎細(xi)胞的(de)培(pei)養中已發現不少于20種血清性病(bing)(bing)(bing)(bing)毒。 盡管病(bing)(bing)(bing)(bing)毒污染的(de)細(xi)胞不影響(xiang)原(yuan)(yuan)代培(pei)養,但生(sheng)產疫(yi)苗是不安全的(de)。因此,潛(qian)在病(bing)(bing)(bing)(bing)毒是細(xi)胞大(da)量(liang)生(sheng)產和疫(yi)苗、干擾(rao)素等生(sheng)物制(zhi)品制(zhi)作(zuo)中的(de)難題(ti)。
7-非同種細(xi)胞污染
即細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)交叉污(wu)染,由于(yu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)培養(yang)操作時各細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)株(zhu)所(suo)需的(de)器材和溶液(ye)沒有(you)嚴格分開,往往會使(shi)一種(zhong)(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)被(bei)另一種(zhong)(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)污(wu)染。目前(qian),世界上已有(you)幾十種(zhong)(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)都被(bei)HeLa細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)所(suo)污(wu)染,致使(shi)許多實驗宣(xuan)告無效。非細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)培養(yang)物所(suo)造(zao)成的(de)化(hua)學成分的(de)污(wu)染也偶有(you)發生,大多是(shi)由于(yu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)培養(yang)所(suo)需物品(pin)清(qing)洗消毒不*而帶入一些有(you)毒化(hua)學物質所(suo)致。
污染是(shi)細胞培養的(de)大敵,預防和避免污染是(shi)成功培養細胞的(de)關鍵之一。危機意識要貫徹實驗的(de)始(shi)終,否則不僅浪(lang)費時間,而且浪(lang)費人力、物力,甚至造成無法彌補的(de)損(sun)失(shi)。
(如何預防(fang)細(xi)(xi)胞培(pei)養的污染(ran)和(he)清除這(zhe)些(xie)污染(ran)物(wu)呢?)慧(hui)穎 細(xi)(xi)胞庫(ku) 技(ji)術為您(nin)解答:
一、污染(ran)的預防
預防是防止細胞培養過(guo)程中發(fa)(fa)生污染的辦法。只有(you)預防工作做在前,才能將發(fa)(fa)生污染的可能性降到zui小程度。一般(ban)預防可從以下幾方(fang)面著手:
1-從(cong)操作者做起
1操(cao)作(zuo)者責任心要(yao)(yao)強(qiang),要(yao)(yao)細(xi)心穩(wen)重,操(cao)作(zuo)技術要(yao)(yao)熟(shu)練(lian)。進(jin)無菌室前要(yao)(yao)用肥(fei)皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘,按規(gui)定穿隔離(li)衣(yi)。進(jin)入后(hou)關好(hao)門,坐(zuo)下來盡量(liang)少走動。工作(zuo)開始要(yao)(yao)先用75%酒精棉球擦(ca)手、擦(ca)瓶(ping)口和燒灼瓶(ping)口。事先要(yao)(yao)嚴(yan)格(ge)檢查器材、溶(rong)液和培養物,不(bu)要(yao)(yao)把污染品(pin)或未(wei)經消毒的物品(pin)帶入無菌室內,更不(bu)能隨(sui)便使(shi)用,以(yi)免造成大批污染。
2、操作(zuo)者動作(zuo)要輕,必須在火焰周(zhou)圍無菌(jun)區(qu)內(nei)打開瓶口,并(bing)將(jiang)瓶口轉動燒灼。操作(zuo)時盡量不(bu)要談話,若打噴(pen)嚏或咳嗽應轉向背面。
3、操作時要常更(geng)換吸(xi)管,切(qie)勿一根吸(xi)管做到底。一旦發現吸(xi)管口(kou)接觸(chu)了手和其他污(wu)染物品(pin)應棄去(qu)。實驗(yan)完畢及時收拾,保持實驗(yan)室清潔(jie)整齊(qi),zui后(hou)用消毒水浸泡(pao)的紗(sha)布擦臺(tai)面(mian)。
2-從物品、用品消(xiao)毒(du)滅菌著手
細胞培養所用物品(pin)清(qing)(qing)洗、消毒要*,各(ge)種(zhong)溶液(ye)滅菌除菌要仔細,并在(zai)無(wu)菌試驗陰性(xing)后(hou)才(cai)能使(shi)用。操(cao)作室及(ji)剩余的無(wu)菌器材要定(ding)期清(qing)(qing)潔消毒滅菌。
3-防止(zhi)細胞交叉污(wu)染
在進行多(duo)種細胞培(pei)養操作時(shi),所用器具(ju)要嚴(yan)格區分,做上標記便于辨別。并按順序進行操作,避免一起(qi)進行時(shi)易發(fa)生混亂。
在進行(xing)換液或(huo)傳代操作時,注射器和(he)滴管不要觸及細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)瓶瓶口,以(yi)免把(ba)細(xi)胞(bao)帶到(dao)培(pei)養(yang)(yang)液中污染(ran)其他細(xi)胞(bao)。
所有細(xi)胞一旦購置,或(huo)從別(bie)處引(yin)入,或(huo)自己建立(li),均應及早(zao)留種凍存,一旦發生污染可棄(qi)之復蘇,重新培養。
二、污染的(de)清除
培養(yang)細(xi)胞(bao)(bao)一經污(wu)(wu)染(ran),多數(shu)較(jiao)難處理。如果污(wu)(wu)染(ran)細(xi)胞(bao)(bao)價值不大,宜棄(qi)之(zhi);有細(xi)胞(bao)(bao)株留存的或可(ke)(ke)購(gou)置的,可(ke)(ke)在(zai)尋(xun)找原因后(hou)*消毒操作(zuo)室(shi),復蘇(su)或重新購(gou)置細(xi)胞(bao)(bao),再培養(yang)。若污(wu)(wu)染(ran)細(xi)胞(bao)(bao)價值較(jiao)大,又難于重新得到(dao),可(ke)(ke)采取以(yi)下辦法清除。
1-使(shi)用(yong)抗(kang)生素
抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)(su)對殺(sha)滅(mie)細菌(jun)較有(you)效。聯(lian)合(he)(he)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)比單獨用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)效果好(hao)。預(yu)防用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)比污(wu)染(ran)后(hou)(hou)(hou)再(zai)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)效果好(hao)。預(yu)防用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)一般用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)雙抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)(su)(青霉(mei)素(su)(su)(su)(su)100u/mL加(jia)鏈(lian)霉(mei)素(su)(su)(su)(su)100μg/mL),污(wu)染(ran)后(hou)(hou)(hou)清除(chu)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)需采用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)大于(yu)常用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)量5~10倍的(de)沖洗法,于(yu)加(jia)藥(yao)后(hou)(hou)(hou)作用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)24~48小時,再(zai)換常規培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye)。此(ci)法在污(wu)染(ran)早期可能有(you)效。所用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)(su)品種(zhong)除(chu)青霉(mei)素(su)(su)(su)(su)、鏈(lian)霉(mei)素(su)(su)(su)(su)外,還可用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)慶大霉(mei)素(su)(su)(su)(su)、卡那(nei)霉(mei)素(su)(su)(su)(su)、多粘菌(jun)素(su)(su)(su)(su)、四(si)環(huan)(huan)素(su)(su)(su)(su)、制霉(mei)菌(jun)素(su)(su)(su)(su)等(deng)。常用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)400~800μg/mL卡那(nei)霉(mei)素(su)(su)(su)(su)或200μg/mL四(si)環(huan)(huan)素(su)(su)(su)(su)處理,每(mei)隔2~3日換液(ye)(ye)1次(ci),傳1~2代進行治療。近(jin)年來有(you)報(bao)道,4-氟,2-羥(qian)基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素(su)(su)(su)(su)衍(yan)生(sheng)物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四(si)環(huan)(huan)素(su)(su)(su)(su)衍(yan)生(sheng)物(BM-2)等(deng)三(san)種(zhong)抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)(su)單用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)或合(he)(he)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)對殺(sha)滅(mie)支原體有(you)效。這(zhe)三(san)種(zhong)抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)(su)均用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)PBS配成(cheng)250濃縮(suo)液(ye)(ye),-20℃保存備(bei)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong),使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)濃度(du)Cip為10μg/mL,BM-1為10μg/mL,BM-2為5μg/mL。使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)時先吸(xi)除(chu)污(wu)染(ran)的(de)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye),加(jia)入(ru)含BM-1的(de)RPMI1640培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye),3天后(hou)(hou)(hou)再(zai)吸(xi)除(chu)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye),加(jia)入(ru)含BM-2的(de)RPMI1640培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye),培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)4天,如此(ci)連續3個(ge)輪次(ci),直至用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)33258熒光染(ran)色鏡(jing)檢證明已清除(chu)支原體后(hou)(hou)(hou),再(zai)加(jia)正常培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)傳代3-4次(ci)。
2-使用(yong)支原(yuan)體特異性血清(qing)
用5%的兔支(zhi)原體(ti)免疫血(xue)清(血(xue)凝效價(jia)1:320以上)可去除支(zhi)原體(ti)污染,因特異抗(kang)(kang)體(ti)可抑(yi)制支(zhi)原體(ti)生(sheng)長,故經抗(kang)(kang)血(xue)清處理后11天(tian)即轉為陰性,并且5個月(yue)后仍為陰性。但此(ci)法(fa)比(bi)較麻煩,不(bu)如用抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)方便、經濟。
3-加溫處(chu)理
將(jiang)污(wu)染的(de)(de)組織培養物(wu)放在41℃培養18小(xiao)時(shi),可殺死支原體(ti),但對細胞有不良影響(xiang)。所以在處(chu)理(li)前要進行(xing)預(yu)試驗(yan),摸索能zui大限(xian)度殺死支原體(ti)又對細胞影響(xiang)zui小(xiao)的(de)(de)加熱時(shi)間。此法有時(shi)不可靠。若先用藥物(wu)處(chu)理(li)后,再以41℃加溫(wen)處(chu)理(li)效(xiao)果更(geng)佳。
4-其他(ta)方法
除了上述去除污(wu)染的(de)方(fang)法(fa)外,還(huan)有動物體(ti)(ti)內接種除菌法(fa)、巨(ju)噬細(xi)胞(bao)吞噬法(fa)、污(wu)染培(pei)養(yang)(yang)瓶中加溴尿嘧(mi)啶再用光照射的(de)方(fang)法(fa)及過(guo)濾法(fa)等,但(dan)均(jun)較麻煩,且(qie)效果不確定。所以一(yi)旦支原體(ti)(ti)污(wu)染,除非有特(te)別重要價值(zhi),一(yi)般均(jun)棄之重新培(pei)養(yang)(yang)。
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兔(tu)試劑盒,兔(tu)elisa試劑盒(he),酶聯(lian)免疫(yi)試劑(ji)盒
山羊(yang)試劑盒,山(shan)羊(yang)elisa試劑盒,酶聯免疫試(shi)劑(ji)盒
其他試(shi)劑(ji)盒,elisa試劑盒,酶聯免(mian)疫試劑盒
牛(niu)試(shi)劑盒,牛elisa試劑盒,酶聯免疫(yi)試劑盒
綿羊試劑盒,綿羊elisa試劑盒(he),酶聯(lian)免疫(yi)試(shi)劑盒(he)
馬試劑盒,馬elisa試劑盒,酶聯免疫試劑盒
駱駝試劑盒,駱駝(tuo)elisa試劑(ji)盒(he),酶聯免疫試劑(ji)盒(he)
鹿試劑盒,鹿elisa試劑盒,酶聯免疫試劑盒
雞試(shi)劑盒(he),雞ELISA試劑盒,酶聯免疫試劑盒
猴(hou)試劑(ji)盒,猴elisa試劑盒,酶(mei)聯免疫(yi)試劑盒
小鼠試劑盒,小鼠(shu)elisa試劑盒,酶聯免疫試(shi)劑盒
大(da)鼠試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,酶聯免疫(yi)試劑盒
人試劑(ji)盒,人elisa試劑盒(he),酶聯免疫(yi)試劑盒
植物(wu)病毒(du)、細菌、真菌、植物(wu)激素和轉基(ji)因作物(wu)的農(nong)業診斷試劑(ji)盒
動植物疾病診斷類如豬、牛、羊、馬(ma)等家畜和禽類以及寵物類檢測試劑(ji)盒
15596026 TRIzol試(shi)劑
15596018 TRIzol試劑(ji)
11668027 脂質體(ti)2000轉染試劑
11668019 脂質(zhi)體(ti)2000轉染試劑(ji)
13778075 RNAiMAX轉染(ran)試劑
17504044 B-27(黃顏色)
12587010 B-27 (黃顏色)不含維(wei)生素(su)A
17502048 N-2 (粉紅(hong)顏色)