人結腸(chang)癌細胞(bao)(bao)系：SW48細胞(bao)(bao)，SW480細胞(bao)(bao)，CACO-2細胞(bao)(bao)，SW620細胞(bao)(bao)，HCT-8細胞(bao)(bao)，HCT/V細胞(bao)(bao)，HCT-116細胞(bao)(bao)，LoVo細胞(bao)(bao)，HRT-18細胞(bao)(bao)，HT-29細胞(bao)(bao)等(deng)

人宮頸癌細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)系：hela細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，HT-3細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，C33A細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，SN12C細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，SKG-IIIa細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，Hela S3細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，DoTc2-4510細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，Ca Ski細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao) ，ME-180細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)等

DC2.4細(xi)胞(bao)(bao)株  MC38細(xi)胞(bao)(bao)株，MLE-12細(xi)胞(bao)(bao)，bEND.3細(xi)胞(bao)(bao) HT-22細(xi)胞(bao)(bao)，HK-2細(xi)胞(bao)(bao) THP-1細(xi)胞(bao)(bao) WRO細(xi)胞(bao)(bao) FRO細(xi)胞(bao)(bao) Molt-4細(xi)胞(bao)(bao)系 SH-SY-5Y細(xi)胞(bao)(bao) U87-MG細(xi)胞(bao)(bao)

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SV-HUC-1細胞，人膀胱上皮(pi)細胞株 （細胞培養中常見的生物污染類型有7種，分別是細菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細胞污染，那么他們污染細胞的特點分別是什么呢？怎樣能夠減少污染現象的發生？）

1-細菌

細(xi)(xi)(xi)菌污染常見(jian)的有大(da)腸(chang)桿(gan)菌，葡萄球菌等。細(xi)(xi)(xi)菌污染較(jiao)易(yi)發現，在(zai)普通倒(dao)置顯微鏡下為黑(hei)色細(xi)(xi)(xi)沙(sha)狀，培(pei)養(yang)(yang)液(ye)一般會(hui)在(zai)短時間內(nei)變黃，有時靜(jing)置的培(pei)養(yang)(yang)液(ye)不混(hun)，稍加震蕩會(hui)有很多混(hun)濁物(wu)漂起。顯微鏡下可(ke)見(jian)培(pei)養(yang)(yang)液(ye)中(zhong)有大(da)量圓球狀顆粒物(wu)漂浮，有時在(zai)細(xi)(xi)(xi)胞表(biao)面及周圍有大(da)量細(xi)(xi)(xi)菌存在(zai)，細(xi)(xi)(xi)胞停止生長(chang)并有中(zhong)毒表(biao)現。

處理：①在培(pei)養液(ye)中(zhong)加入相應的抗生素(su)，能夠預防絕(jue)大多數的細菌污染。

2-真菌

真(zhen)菌污染是細(xi)胞培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)過程中zui常見(jian)的一(yi)種，尤其梅(mei)雨(yu)季(ji)節快要到了，進行細(xi)胞培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)時更易(yi)污染。污染細(xi)胞的多(duo)為(wei)煙曲霉(mei)、黑曲霉(mei)、毛霉(mei)菌、孢子(zi)霉(mei)、白念(nian)珠菌、酵母(mu)菌等。霉(mei)菌污染后多(duo)數在培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)中形成白色(se)或淺(qian)黃色(se)漂浮物。一(yi)般肉眼可(ke)見(jian)，較易(yi)被發現，短期內培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)多(duo)不混濁，倒置顯微(wei)鏡下可(ke)見(jian)于細(xi)胞之(zhi)間縱橫交錯穿(chuan)行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)中。

很多菌(jun)絲在高(gao)倍鏡可見到有鏈狀(zhuang)排列的(de)菌(jun)珠；念珠菌(jun)或酵母菌(jun)形(xing)態呈卵形(xing)，散在細胞(bao)周邊和細胞(bao)之間(jian)生(sheng)長。鏡下看時，要將培養瓶(ping)(ping)用酒精棉(mian)球擦(ca)干凈，以防止與瓶(ping)(ping)外(wai)尤其瓶(ping)(ping)底外(wai)面(mian)生(sheng)長的(de)菌(jun)絲相混淆。

真(zhen)菌(jun)污(wu)(wu)染后(hou)，細(xi)胞生長(chang)變(bian)慢，但zui后(hou)由(you)于營養(yang)耗盡及毒性作用而使細(xi)胞脫落死亡。真(zhen)菌(jun)生長(chang)的比較慢，不象細(xi)菌(jun)那(nei)么容易被(bei)發現，但是(shi)一旦發現有(you)它的存在細(xi)胞就被(bei)污(wu)(wu)染了(le)，也很難救活(huo)了(le)。

3-支原體

支原(yuan)體的(de)大小介于細(xi)菌和(he)病毒之間，是(shi)一(yi)(yi)種獨立生(sheng)活的(de)微生(sheng)物。對(dui)熱敏感(gan)，對(dui)一(yi)(yi)般抗生(sheng)素不敏感(gan)。支原(yuan)體的(de)形(xing)態多變，多吸附在細(xi)胞表面和(he)細(xi)胞之間。電鏡下觀察，中心有高密(mi)度的(de)密(mi)集顆粒，橫斷面與細(xi)胞微絨毛相似。

因國(guo)內的血(xue)清大多(duo)數都(dou)沒有做支原體陰(yin)性檢測，而支原體又是(shi)牛(niu)血(xue)清中zui常見的微(wei)生(sheng)物(wu)之一。支原體污染細胞后(hou)，培養(yang)液輕微(wei)發生(sheng)混濁．但(dan)細胞變化不顯著，隨著細胞的培養(yang)會慢慢死亡。

支原體(ti)污染(ran)(ran)檢(jian)測（熒光染(ran)(ran)色法(fa)）：DNA和(he)與DNA特異性結合的熒光染(ran)(ran)料結合，使得(de)支原體(ti)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體(ti)為散在于細(xi)胞同圍或(huo)附于細(xi)胞膜表面的亮綠色小點。

解決：

1）抗(kang)生素(su)(su)(su)排除法：支原體污(wu)染預防比(bi)解決好(hao)。如果不(bu)小心污(wu)染后，可加入(ru)高濃度抗(kang)生素(su)(su)(su)（常規(gui)使用的5倍(bei)濃度）作用24-48小時，再換入(ru)常規(gui)培養液，但(dan)該法不(bu)保證有效。推(tui)薦用量：慶大霉(mei)素(su)(su)(su) 200μg/ml ,四環(huan)素(su)(su)(su)10μg/ml ，卡(ka)那霉(mei)素(su)(su)(su)50μg/ml 。

2）加溫(wen)除菌(jun)：支原(yuan)(yuan)體(ti)不耐熱(re)，可以對支原(yuan)(yuan)體(ti)污染的細(xi)胞(bao)熱(re)處理除菌(jun)。因高溫(wen)對細(xi)胞(bao)本身也會產(chan)生一定影響，故熱(re)處理前(qian)需先(xian)進行預實驗，確定對細(xi)胞(bao)影響zui小而(er)能(neng)zui大程(cheng)度的殺(sha)死(si)支原(yuan)(yuan)體(ti)的時(shi)間。

4-黑膠(jiao)蟲

黑(hei)膠(jiao)蟲(chong)的(de)存在(zai)目前尚有爭議，其在(zai)低(di)倍下(xia)(xia)為黑(hei)色點狀，高倍下(xia)(xia)可看見(jian)黑(hei)色的(de)小(xiao)蟲(chong)游來游去，培養(yang)液也是不(bu)渾(hun)的(de)，對細(xi)胞生長狀態不(bu)會有明顯影響，在(zai)細(xi)胞增殖旺盛(sheng)之后會自然消失(shi)，除更(geng)換血(xue)清外無須特殊處理。

5-原蟲

培養液可輕(qing)(qing)微(wei)(wei)渾(hun)濁，顯(xian)微(wei)(wei)鏡下那些細(xi)(xi)小的點狀物數(shu)量非(fei)常多，輕(qing)(qing)微(wei)(wei)活動(dong)，細(xi)(xi)胞雖然可以(yi)生長(chang)但繁殖速度卻(que)明顯(xian)減慢，而且(qie)細(xi)(xi)胞狀態不好，邊緣不清楚(chu)，細(xi)(xi)胞不透亮。他們(men)與細(xi)(xi)胞可共生但會與細(xi)(xi)胞爭奪營養。這種共生是非(fei)常普遍的，但他們(men)的數(shu)量小，細(xi)(xi)胞站優(you)勢所以(yi)不會影響到(dao)細(xi)(xi)胞的正(zheng)常生長(chang)，只有當他們(men)到(dao)達一定的數(shu)量時就會影響到(dao)細(xi)(xi)胞的生長(chang)，zui終形成惡性循環。

6-病毒

組(zu)織(zhi)細胞(bao)培(pei)養過程中(zhong)(zhong)，如果沒有除去潛在的(de)病(bing)毒，就會產(chan)(chan)生病(bing)毒污染。目前，從原(yuan)代猴腎細胞(bao)的(de)培(pei)養中(zhong)(zhong)已發現不少(shao)于(yu)20種血清性病(bing)毒。 盡管病(bing)毒污染的(de)細胞(bao)不影響原(yuan)代培(pei)養，但生產(chan)(chan)疫(yi)苗(miao)是不安全的(de)。因(yin)此，潛在病(bing)毒是細胞(bao)大量生產(chan)(chan)和疫(yi)苗(miao)、干擾(rao)素等生物(wu)制品制作中(zhong)(zhong)的(de)難(nan)題。

7-非(fei)同(tong)種細(xi)胞污染

即細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)交叉污(wu)染(ran)，由于細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)培養(yang)操作時各(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)株所(suo)需(xu)的(de)器(qi)材和溶液沒有(you)嚴格(ge)分開(kai)，往往會使一種(zhong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)被另一種(zhong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)污(wu)染(ran)。目前，世(shi)界上(shang)已有(you)幾十種(zhong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)都被HeLa細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)所(suo)污(wu)染(ran)，致使許多(duo)實驗宣告無(wu)效。非細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)培養(yang)物(wu)所(suo)造成的(de)化學成分的(de)污(wu)染(ran)也偶(ou)有(you)發生，大多(duo)是由于細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)培養(yang)所(suo)需(xu)物(wu)品清洗(xi)消毒(du)不(bu)*而帶入一些有(you)毒(du)化學物(wu)質所(suo)致。

污(wu)染(ran)是細胞(bao)培養(yang)的大敵，預防和避免(mian)污(wu)染(ran)是成(cheng)功培養(yang)細胞(bao)的關(guan)鍵之一(yi)。危(wei)機意(yi)識要貫徹實(shi)驗的始終，否則不僅(jin)浪費(fei)時(shi)間(jian)，而且浪費(fei)人(ren)力、物力，甚至造成(cheng)無法彌補的損(sun)失。

（如何預防細胞培養的污染和清除這些污染物呢？）慧穎 細胞庫 技術為您解答：

一、污染的預防

預(yu)(yu)防(fang)是防(fang)止(zhi)細(xi)胞培(pei)養過程中發生(sheng)污染(ran)的辦法。只有預(yu)(yu)防(fang)工作做在前，才能將發生(sheng)污染(ran)的可(ke)能性降到zui小程度(du)。一般預(yu)(yu)防(fang)可(ke)從以下幾方面著手：

1-從操(cao)作者做起

1操作者(zhe)責任心要(yao)(yao)(yao)強，要(yao)(yao)(yao)細心穩(wen)重，操作技術要(yao)(yao)(yao)熟(shu)練。進(jin)(jin)無(wu)菌(jun)室前要(yao)(yao)(yao)用肥皂(zao)洗(xi)手或(huo)用5%新潔爾(er)滅浸(jin)泡5分鐘(zhong)，按規定穿隔離衣。進(jin)(jin)入(ru)后關(guan)好門，坐(zuo)下來(lai)盡量少走(zou)動。工作開始要(yao)(yao)(yao)先(xian)用75%酒精棉(mian)球擦手、擦瓶(ping)口和(he)燒(shao)灼瓶(ping)口。事(shi)先(xian)要(yao)(yao)(yao)嚴格檢查器材、溶液和(he)培養物，不要(yao)(yao)(yao)把(ba)污染品(pin)或(huo)未(wei)經(jing)消毒的物品(pin)帶入(ru)無(wu)菌(jun)室內，更不能隨便使用，以免造(zao)成大批污染。

2、操(cao)作者動作要(yao)(yao)輕，必(bi)須在火焰周圍(wei)無菌區內(nei)打開(kai)瓶口，并(bing)將瓶口轉動燒灼。操(cao)作時盡量不要(yao)(yao)談(tan)話(hua)，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面(mian)。

3、操作時(shi)(shi)要(yao)常更(geng)換吸(xi)(xi)(xi)管(guan)，切(qie)勿(wu)一根吸(xi)(xi)(xi)管(guan)做到底。一旦發現吸(xi)(xi)(xi)管(guan)口接(jie)觸了手和其他污染物品應棄去。實驗(yan)完畢及時(shi)(shi)收(shou)拾，保持實驗(yan)室清潔整齊，zui后用(yong)消(xiao)毒水浸泡的紗布擦(ca)臺面。

2-從物品、用品消毒滅(mie)菌著手

細胞培養所用物品清(qing)洗(xi)、消毒要*，各種溶(rong)液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室(shi)及剩(sheng)余的無菌器材要定期清(qing)潔(jie)消毒滅菌。

3-防止(zhi)細(xi)胞交(jiao)叉污染

在進(jin)行(xing)多(duo)種(zhong)細(xi)胞培(pei)養操作時(shi)，所用器具要嚴(yan)格(ge)區分，做(zuo)上標記(ji)便于辨別。并(bing)按(an)順序進(jin)行(xing)操作，避免(mian)一起(qi)進(jin)行(xing)時(shi)易發生混亂。

在進行換液或傳代操(cao)作時，注射器(qi)和滴管不要(yao)觸(chu)及細胞培(pei)養(yang)瓶(ping)瓶(ping)口，以免把細胞帶到(dao)培(pei)養(yang)液中污(wu)染其他細胞。

所(suo)有細胞一旦購置，或(huo)從(cong)別處引入(ru)，或(huo)自己建立，均應及早留(liu)種凍(dong)存，一旦發生(sheng)污(wu)染可棄(qi)之復蘇，重新培養。

二、污染(ran)的清除

培養細胞(bao)一經污(wu)染，多數(shu)較難(nan)處理。如果污(wu)染細胞(bao)價(jia)值不(bu)大(da)，宜棄之(zhi)；有細胞(bao)株留存的(de)或可(ke)購(gou)置的(de)，可(ke)在尋(xun)找原因(yin)后*消毒(du)操作室(shi)，復蘇或重新購(gou)置細胞(bao)，再(zai)培養。若污(wu)染細胞(bao)價(jia)值較大(da)，又(you)難(nan)于重新得到，可(ke)采取以下辦法(fa)清除(chu)。

1-使(shi)用(yong)抗生素

抗(kang)生(sheng)素(su)(su)對殺(sha)滅細菌(jun)(jun)較有效(xiao)(xiao)。聯合用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)比單獨用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)效(xiao)(xiao)果好。預防(fang)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)比污染(ran)(ran)后(hou)再(zai)(zai)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)效(xiao)(xiao)果好。預防(fang)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)一般(ban)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)雙抗(kang)生(sheng)素(su)(su)（青(qing)霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)100u/mL加(jia)鏈霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)100μg/mL），污染(ran)(ran)后(hou)清除(chu)(chu)(chu)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)需采用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)大于(yu)常(chang)(chang)(chang)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)量(liang)5～10倍的(de)(de)沖洗法，于(yu)加(jia)藥(yao)(yao)(yao)后(hou)作用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)24～48小時，再(zai)(zai)換(huan)常(chang)(chang)(chang)規(gui)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液。此(ci)法在污染(ran)(ran)早期(qi)可能(neng)有效(xiao)(xiao)。所(suo)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)抗(kang)生(sheng)素(su)(su)品種(zhong)除(chu)(chu)(chu)青(qing)霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)、鏈霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)外，還可用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)慶(qing)大霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)、卡(ka)(ka)那霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)、多粘菌(jun)(jun)素(su)(su)、四(si)(si)環素(su)(su)、制霉(mei)(mei)(mei)菌(jun)(jun)素(su)(su)等。常(chang)(chang)(chang)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)400～800μg/mL卡(ka)(ka)那霉(mei)(mei)(mei)素(su)(su)或(huo)200μg/mL四(si)(si)環素(su)(su)處理，每隔2～3日換(huan)液1次(ci)，傳1～2代進行治療。近(jin)年來有報道，4-氟，2-羥基喹啉（Ciprofloxacin,Cip）、截耳素(su)(su)衍生(sheng)物（Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四(si)(si)環素(su)(su)衍生(sheng)物（BM-2）等三種(zhong)抗(kang)生(sheng)素(su)(su)單用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)或(huo)合用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)對殺(sha)滅支原體有效(xiao)(xiao)。這三種(zhong)抗(kang)生(sheng)素(su)(su)均用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)PBS配成250濃縮液，-20℃保存備用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)，使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)濃度(du)Cip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL。使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)時先(xian)吸(xi)除(chu)(chu)(chu)污染(ran)(ran)的(de)(de)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液，加(jia)入含(han)BM-1的(de)(de)RPMI1640培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液，3天(tian)后(hou)再(zai)(zai)吸(xi)除(chu)(chu)(chu)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液，加(jia)入含(han)BM-2的(de)(de)RPMI1640培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液，培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)4天(tian)，如此(ci)連(lian)續3個(ge)輪次(ci)，直至用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)33258熒(ying)光染(ran)(ran)色鏡檢證明已(yi)清除(chu)(chu)(chu)支原體后(hou)，再(zai)(zai)加(jia)正常(chang)(chang)(chang)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)傳代3-4次(ci)。

2-使用支(zhi)原體(ti)特異性血清

用5%的(de)兔支(zhi)(zhi)原體(ti)免疫血(xue)清（血(xue)凝(ning)效價1:320以上）可去除支(zhi)(zhi)原體(ti)污(wu)染(ran)，因特異抗(kang)體(ti)可抑制支(zhi)(zhi)原體(ti)生(sheng)長(chang)，故經抗(kang)血(xue)清處理后11天即(ji)轉為(wei)陰性，并且(qie)5個月后仍(reng)為(wei)陰性。但此法比(bi)較麻煩，不如用抗(kang)生(sheng)素方便、經濟。

3-加溫處理

將污染的組織培養(yang)物放在41℃培養(yang)18小時(shi)，可殺死(si)支原(yuan)(yuan)體，但對細胞有不良影響。所以在處(chu)理前要進行預(yu)試驗，摸索能zui大限(xian)度殺死(si)支原(yuan)(yuan)體又對細胞影響zui小的加(jia)熱(re)時(shi)間。此法有時(shi)不可靠。若(ruo)先用(yong)藥物處(chu)理后，再(zai)以41℃加(jia)溫(wen)處(chu)理效果(guo)更佳(jia)。

4-其他方(fang)法(fa)

除(chu)了上(shang)述去(qu)除(chu)污染的方法(fa)(fa)外(wai)，還有動(dong)物(wu)體內接種(zhong)除(chu)菌(jun)法(fa)(fa)、巨噬(shi)(shi)細胞吞噬(shi)(shi)法(fa)(fa)、污染培(pei)養(yang)瓶(ping)中(zhong)加溴尿嘧啶再用光照射的方法(fa)(fa)及過濾法(fa)(fa)等，但均(jun)較麻煩，且效(xiao)果(guo)不確定。所以(yi)一旦支原體污染，除(chu)非有特(te)別(bie)重要(yao)價值，一般均(jun)棄之重新培(pei)養(yang)。

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